נייַעס

דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.דער בלעטערער ווערסיע איר נוצן האט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין דער דערווייל, צו ענשור פארבליבן שטיצן, מיר וועלן מאַכן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
ענזימאַטיק פּראַקסימאַטי לייבלינג מעטהאָדס באזירט אויף אַקטיווייטיד עסטערס אָדער פענאָקסי ראַדאַקאַלז זענען וויידלי געניצט צו מאַפּע סובסעללולאַר פּראָטעאָמעס און פּראָטעין ינטעראַקטאָרס אין לעבעדיק סעלז.אָבער, אַקטיווייטיד עסטערס זענען ווייניקער ריאַקטיוו, ריזאַלטינג אין אַ ברייט לייבלינג ראַדיוס, און פענאָקסי ראַדאַקאַלז דזשענערייטאַד דורך פּעראַקסייד באַהאַנדלונג קענען אַרייַנמישנ זיך מיט רעדאָקס פּאַטווייז.דאָ מיר באַריכט אַ פּראַקסימאַטי לייבלינג אָפענגיק פאָטאָאַקטיוואַטיאָן (PDPL) אופֿן דעוועלאָפּעד דורך דזשאַנעטיקלי פֿאַרבינדונג די מיניסאָג פאָטאָסענסיטיזער פּראָטעין צו אַ פּראָטעין פון אינטערעס.טריגערד דורך בלוי ליכט און קאַנטראָולד דורך ויסשטעלן צייט, סינגלעט זויערשטאָף איז דזשענערייטאַד און דעמאָלט ספּאַטיאָטעמאָרלי ריזאַלווד לייבלינג פון היסטידינע רעזאַדוז דורך די אַנילין זאָנד איז אַטשיווד.מיר באַווייַזן זייַן הויך פאַדעלאַטי דורך אָרגאַנעל-ספּעציפיש פּראָטעאָמע מאַפּינג.א זייַט-ביי-זייַט פאַרגלייַך פון PDPL מיט TurboID ווייזט אַ מער ספּעציפיש און פולשטענדיק פּראָטעאָמיק קאַווערידזש פון PDPL.דערנאָך, מיר געווענדט PDPL צו די קרענק-פארבונדן טראַנסקריפּטיאָנאַל קאָאַקטיוואַטאָר ברד4 און ע3 פּאַרקין ליגאַסע און געפֿונען ביז אַהער אומבאַקאַנט ינטעראַקטערז.דורך אָוווערעקספּרעססיאָן זיפּונג, צוויי אומבאַקאַנט סאַבסטרייץ, Ssu72 און SNW1, זענען יידענאַפייד פֿאַר פּאַרקין, וועמענס דערנידעריקונג איז מידיייטיד דורך די וביקוויטינאַטיאָן-פּראָטעאַסאָמע פּאַטוויי.
פּינטלעך כאַראַקטעריזיישאַן פון פּראָטעין נעטוואָרקס אַנדערלייז פילע פונדאַמענטאַל סעליאַלער פּראַסעסאַז.דעריבער, העכסט פּינטלעך ספּאַטיאָטעמפּאָראַל מאַפּינג פון פּראָטעין ינטעראַקשאַנז וועט צושטעלן אַ מאָלעקולאַר יקער פֿאַר דיסייפערינג בייאַלאַדזשיקאַל פּאַטווייז, קרענק פּאַטאַלאַדזשי און דיסראַפּטינג די ינטעראַקשאַנז פֿאַר טעראַפּיוטיק צוועקן.צו דעם סוף, מעטהאָדס טויגעוודיק פון דיטעקטינג טעמפּעראַל ינטעראַקשאַנז אין לעבעדיק סעלז אָדער געוועבן זענען העכסט דיזייראַבאַל.אַפיניטי רייניקונג מאַסע ספּעקטראָמעטרי (AP-MS) איז כיסטאָריקלי געניצט צו ידענטיפיצירן ביינדינג פּאַרטנערס פון פּראָטעינס פון אינטערעס (POIs).מיט דער אַנטוויקלונג פון קוואַנטיטאַטיווע פּראָטעאָמיקס מעטהאָדס, Bioplex3.0 איז באשאפן, די גרעסטע דאַטאַבייס פון פּראָטעין נעטוואָרקס באזירט אויף AP-MS.כאָטש AP-MS איז זייער שטאַרק, די צעל ליסיס און דיילושאַן סטעפּס אין די וואָרקפלאָוו זענען בייאַסט צו שוואַך און טראַנזשאַנט ביינדינג ינטעראַקשאַנז און באַקענען פּאָסט-ליסיס אַרטאַפאַקץ אַזאַ ווי פאַלש ינטעראַקשאַן פּערז וואָס פעלן קאַמפּאַרטמענטאַליזיישאַן איידער ליסיס.
צו אַדרעס די ישוז, ומנאַטירלעך אַמינאָ אַסאַדז (ואַאַ) מיט קראָססלינקינג גרופּעס און ענזימאַטיק נירביי לייבלינג (PL) פּלאַטפאָרמס (למשל APEX און BioID)5 האָבן שוין דעוועלאָפּעד.כאָטש די ואַאַ אופֿן איז הצלחה געווענדט אין פילע סינעריאָוז און גיט אינפֿאָרמאַציע אויף דירעקט פּראָטעין אַדכיסיווז, אַפּטאַמאַזיישאַן פון די ואַאַ ינסערשאַן פּלאַץ איז נאָך פארלאנגט.מער ימפּאָרטאַנטלי, עס איז אַ סטאָיטשיאָמעטריק לייבלינג אופֿן וואָס פעלן אַ קאַטאַליטיק מאַפּאָלע פון ​​לייבלינג געשעענישן.אין קאַנטראַסט, ענזימאַטיק PL מעטהאָדס, אַזאַ ווי די BioID מעטאָד, פאַרבינדן די ענדזשאַנירד ביאָטין ליגאַסע צו POI7, וואָס דערנאָך אַקטאַווייץ ביאָטין צו פאָרעם אַ ריאַקטיוו ביאָטיניל-אַמפּ עסטער ינטערמידייט.דער ענזיים אַזוי קאַטאַלייזיז און ריליסיז אַן אַקטיווייטיד ביאָטין "וואָלקן" וואָס לאַבעלס פּראַקסימאַל ליסין רעזאַדוז.אָבער, BioID ריקווייערז מער ווי 12 שעה צו באַקומען אַ גענוג לייבאַלד סיגנאַל, וואָס פּריקלודז זייַן נוצן מיט צייט האַכלאָטע.מיט דירעקטעד עוואָלוציע באזירט אויף הייוון אַרויסווייַזן, TurboID איז דיזיינד באזירט אויף BioID צו זיין מער עפעקטיוו, אַלאַוינג עפעקטיוו לייבלינג מיט ביאָטין אין 10 מינוט, אַלאַוינג מער דינאַמיש פּראַסעסאַז צו זיין געלערנט.ווייַל TurboID איז העכסט אַקטיוו און ענדאָגענאָוס ביאָטין לעוועלס זענען גענוג פֿאַר נידעריק-מדרגה לייבלינג, הינטערגרונט לייבלינג ווערט אַ פּאָטענציעל פּראָבלעם ווען העכסט ענכאַנסט און טיימד לייבלינג איז פארלאנגט דורך די אַדישאַן פון עקסאָגענאָוס ביאָטין.אין אַדישאַן, אַקטיווייטיד עסטערס זענען שוואַך ריאַקטיוו (ט1/2 ~ 5 מין), וואָס קענען פירן צו אַ גרויס לייבלינג ראַדיוס, ספּעציעל נאָך זעטיקונג פון ארומיקע פּראָטעינס מיט ביאָטין 5. אין אן אנדער צוגאַנג, גענעטיק פוסיאָן פון ענדזשאַנירד אַסקאָרבאַטע פּעראָקסידאַסע (ד"ה ביאָטין- פענאָל ראַדאַקאַלז און אַלאַוז פּראָטעין לייבלינג ין איין מינוט 9,10.אַפּעקס איז וויידלי געניצט צו ידענטיפיצירן סובסעללולאַר פּראָטעאָמעס, מעמבראַנע פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און סיטאָסאָליק סיגנאַלינג פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז 11,12. סעליאַלער פּראַסעסאַז.
אזוי, אַ נייַע אופֿן וואָס איז ביכולת צו דזשענערייט מער ריאַקטיוו לייבאַלד ראַדיוס סאַפּרעשאַן מינים מיט הויך ספּיישאַל און טעמפּעראַל אַקיעראַסי אָן באטייטיק דיסראַפּטינג סעליאַלער פּאַטווייז וועט זיין אַ וויכטיק דערצו צו יגזיסטינג מעטהאָדס. צווישן די ריאַקטיוו מינים, סינגלעאַט זויערשטאָף דערוועקט אונדזער ופמערקזאַמקייט רעכט צו זיין קורץ לעבן און לימיטעד דיפיוזשאַן ראַדיוס (ט1/2 <0.6 μס אין סעלז)13. צווישן די ריאַקטיוו מינים, סינגלעאַט זויערשטאָף דערוועקט אונדזער ופמערקזאַמקייט רעכט צו זיין קורץ לעבן און לימיטעד דיפיוזשאַן ראַדיוס (ט1/2 <0.6 μס אין סעלז)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. צווישן די אַקטיוו פארמען, סינגלעט זויערשטאָף געצויגן אונדזער ופמערקזאַמקייט רעכט צו זיין קורץ לעבן און לימיטעד דיפיוזשאַן ראַדיוס (ט1/2 <0.6 μס אין סעלז)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2伕耄嚄樆】1µs， 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 ענטפער אַקטיוו אַקציע פון ​​די מערסט שטאַרק פינגל פון די קיפּאָלאַטאָרי פינגל פון די קיגאַלז און די מערסט פאָלקס (ט 1/2 <0,6 מ.ק.). צווישן אַקטיוו פארמען, סינגלעט זויערשטאָף אַטראַקץ אונדזער ופמערקזאַמקייט ווייַל פון זיין קורץ לעבן און לימיטעד דיפיוזשאַן ראַדיוס (ט 1 / 2 <0.6 μs אין סעלז).סינגלעט זויערשטאָף איז רעפּאָרטעד צו ראַנדאַמלי אַקסאַדייז מעטהיאָנינע, טיראָסינע, היסטידינע און טריפּטאָפאַן, מאכן עס פּאָליאַר 14,15 פֿאַר אַטאַטשמאַנט צו אַמינאָ אָדער טיאָל באזירט פּראָבעס16,17.כאָטש סינגלעט זויערשטאָף איז געניצט צו לייבלינג סובסעללולאַר אָפּטייל רנאַ, סטראַטעגיעס פֿאַר רעפּורפּאָסינג ענדאָגענאָוס פּאָי פּראַקסימאַטי מאַרקערס בלייבן אַניקספּלאָרד.דאָ, מיר פאָרשטעלן אַ פּלאַטפאָרמע גערופן פאָטאָאַקטיוואַטיאָן-אָפענגיק פּראַקסימאַטי לייבלינג (PDPL), ווו מיר נוצן בלוי ליכט צו ילומיניט פּאָי פיוזד מיט אַ מיניסאָג פאָטאָסענסיטיזער און צינגל סינגלעט זויערשטאָף דזשענעריישאַן צו אַקסאַדייז פּראַקסימאַל רעזאַדוז, נאכגעגאנגען דורך אַמינע-מיט מאָדיפיקאַטיאָנס צו אַקסאַדייז כעמישער פּראָבעס אין ינטערמידייט לעבעדיק סעלז..מיר טעסטעד אַ גרופּע פון ​​כעמיש פּראָבעס צו מאַקסאַמייז די צעטל ספּעסיפיקאַטי און יידענאַפייד מאָדיפיקאַטיאָן זייטלעך מיט אַן אָפֿן פּראָטעאָמיקס וואָרקפלאָוו.א זייַט-ביי-זייַט פאַרגלייַך פון PDPL מיט TurboID ווייזט אַ מער ספּעציפיש און פולשטענדיק פּראָטעאָמיק קאַווערידזש פון PDPL.מיר געווענדט דעם צוגאַנג צו אָרגאַנעל-ספּעציפיש מאַרקערס פון די סובסעללולאַר פּראָטעאָמע און אַלגעמיין פּראָטעאָמע לעגיטימאַציע פון ​​ביינדינג פּאַרטנערס פֿאַר די ראַק-פארבונדן עפּיגענעטיק רעגולאַטאָרי פּראָטעין ברד4 און די פּאַרקינסאָן ס קרענק-פארבונדן E3 ליגאַסע פּאַרקין, וואָס באשטעטיקט ביידע אַ באַוווסט און אַן אומבאַקאַנט נעץ פון פּראָטעין ינטעראַקשאַנז..די פיייקייט פון PDPL צו דערקענען E3 סאַבסטרייץ אין גרויס פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז רעפּראַזענץ אַ סיטואַציע ווו דערקענונג פון ומדירעקט בינדערס איז פארלאנגט.צוויי אומבאַקאַנט פּאַרקין סאַבסטרייץ מידיייטיד דורך וביקוויטינאַטיאָן-פּראָטעאַסאָמע זענען באשטעטיקט אין סיטו.
פאָטאָדינאַמיק טעראַפּיע (PDT)19 און טשראָמאָפאָר-אַססיסטעד לאַזער ינאַקטיוויישאַן (CALI)20, אין וואָס ליכט יריידייישאַן מיט פאָטאָסענסיטיזערז דזשענערייץ סינגלעט זויערשטאָף, קענען ינאַקטיווייט ציל פּראָטעינס אָדער גרונט צעל טויט.זינט סינגלעט זויערשטאָף איז אַ העכסט ריאַקטיוו מאַטעריע מיט אַ טעאָרעטיש דיפיוזשאַן דיסטאַנסע פון ​​וועגן 70 נם, ספּיישאַלי לימיטעד אַקסאַדיישאַן אַרום די פאָטאָסענסיטיזער קענען זיין קאַנטראָולד.באַזירט אויף דעם באַגריף, מיר באַשלאָסן צו נוצן סינגלעט זויערשטאָף צו דערגרייכן נאָענט לייבלינג פון פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז אין לעבעדיק סעלז.מיר האָבן דעוועלאָפּעד אַ PDPL טשעמאָפּראָטעאָמיק צוגאַנג צו מקיים פיר פאַנגקשאַנז: (1) צו קאַטאַליזירן די דור פון אַקטיוו סינגלעט זויערשטאָף ענלעך צו די PL ענזימאַטיק צוגאַנג;(2) צושטעלן צייט-סאַלווד לייבלינג אויף ליכט ינישיישאַן;(3) דורך אָלטערניישאַן (4) ויסמיידן די נוצן פון ענדאָגענאָוס קאָפאַקטערז (אַזאַ ווי ביאָטין) צו רעדוצירן די הינטערגרונט, אָדער נוצן העכסט פּערטורבינג עקסאָגענאָוס רייידזשאַנץ (אַזאַ ווי פּעראַקסיידז) צו מינאַמייז צעל ויסשטעלן צו ינווייראַנמענאַל דרוק.
פאָטאָסענסיטיזערז קענען זיין צעטיילט אין צוויי קאַטעגאָריעס אַרייַנגערעכנט קליין מאָלעקולאַר וואָג פלואָראָפאָרעס (למשל רויז בענגאַל, מעטהילענע בלוי)22 און דזשאַנעטיקלי ענקאָודיד קליין פּראָטעינס (למשל מיניסאָג, קיללעררעד)23.צו דערגרייכן אַ מאַדזשאַלער פּלאַן, מיר דעוועלאָפּעד דער ערשטער דור PDPL פּלאַטפאָרמע דורך אַדינג פאָטאָסענסיטיזער (PS) פּראָטעינס צו POI24,25 (פיגורע 1אַ).ווען יריידיייטיד מיט בלוי ליכט, סינגלעט זויערשטאָף אַקסאַדייז פּראַקסימאַל נוקלעאָפיליק אַמינאָ זויער רעזאַדוז, ריזאַלטינג אין אַ ומפּאָלונג פּאָולעראַטי וואָס איז עלעקטראָפיליק און קענען ווייַטער רעאַגירן מיט אַמין זאָנד נוקלעאָפילעס16,17.די זאָנד איז דיזיינד מיט אַ אַלקינע שעפּן צו לאָזן קליקינג כעמיע און ציען אַראָפּ פֿאַר LC / MS / MS כאַראַקטעריזיישאַן.
סכעמאַטיש געמעל פון לייבלינג פון פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז מידיייטיד דורך miniSOG.ווען יקספּאָוזד צו בלוי ליכט, סעלז יקספּרעסינג מיניסאָג-פּאָי דזשענערייט סינגלעט זויערשטאָף, וואָס מאַדאַפייז ינטעראַקטינג פּראָטעינס אָבער נישט ניט-ביינדינג פּראָטעינס.ינטערמידייט פּראָדוקטן פון פאָטאָאָקסידאַטיאָן זענען ינטערסעפּטאַד דורך רעלע לאַבעלס פון די אַמינע כעמישער זאָנד צו פאָרעם קאָוואַלענט אַדדוקץ.די אַלקיניל גרופּע אויף די כעמיע זאָנד אַלאַוז גיט כעמיע פֿאַר ענריטשמענט דורך ציען-אַראָפּ נאכגעגאנגען דורך LC-MS / MS קוואַנטיטאַטיאָן.ב כעמישער סטרוקטור פון אַמינע פּראָבעס 1-4.C רעפּריזענאַטיוו פלורעסאַנט געל אַנאַליסיס פון מיטאָטשאָנדריאַל לאָוקאַלייזד מיניסאָג-מעדיאַטעד פּראָטעאָמיק מאַרקערס ניצן פּראָבעס 1-4 און קאָרעוו קוואַנטאַפאַקיישאַן באזירט אויף געל דענסימאַטרי.די סיגנאַל-צו-הינטערגרונט פאַרהעלטעניש פון כעמיש פּראָבעס איז אַססעססעד מיט נעגאַטיוו קאָנטראָל יקספּעראַמאַנץ עקסקלודינג בלוי ליכט אָדער ניצן HEK293T סעלז אָן מיניסאָג אויסדרוק.n = 2 בייאַלאַדזשיקלי פרייַ סאַמפּאַלז.יעדער פּונקט רעפּראַזענץ אַ בייאַלאַדזשיקאַל רעפּליקע.ד רעפּרעסענטאַטיווע דיטעקשאַן און קוואַנטיפיקאַטיאָן פון PDPL ניצן אָפּטימיזעד זאָנד 3 אין דעם בייַזייַן אָדער אַוועק פון די אנגעוויזן PDPL קאַמפּאָונאַנץ ווי c.n = 3 בייאַלאַדזשיקלי פרייַ סאַמפּאַלז.יעדער פּונקט רעפּראַזענץ אַ בייאַלאַדזשיקאַל רעפּליקע.סענטערלינעס און וואָנצעס פאָרשטעלן די דורכשניטלעך און ± נאָרמאַל דיווייישאַן.CBB: Coomassie Brilliant Blue.E קאָנפאָקאַל ימאַגינג פון סינגלעט זויערשטאָף מיט ווייַט-רויט סי-דמאַ פלעק.וואָג באַר: 10 μם.געל ימאַגינג און קאָנפאָקאַל יקספּעראַמאַנץ זענען ינדיפּענדאַנטלי ריפּיטיד בייַ מינדסטער צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן.
מיר ערשטער טעסטעד די פיייקייט פון די דערוואַקסן פאָטאָסענסיטיזערז מיניסאָג26 און קיללעררעד23, סטאַביל אויסגעדריקט אין HEK293T, צו פאַרמיידן פּראָפּאַרגילאַמינע לייבלינג פון די פּראָטעאָמע ווי אַ כעמישער זאָנד (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 1 אַ).געל פלואָרעססענסע אַנאַליסיס געוויזן אַז גאַנץ פּראָטעאָמע לייבלינג איז אַטשיווד מיט מיניסאָג און בלוי ליכט יריידייישאַן, בשעת קיין קענטיק לייבלינג פּראָדוקט איז באמערקט מיט קיללעררעד.צו פֿאַרבעסערן די סיגנאַל-צו-הינטערגרונט פאַרהעלטעניש, מיר דעמאָלט טעסטעד אַ סכום פון כעמישער פּראָבעס מיט אַנילין (1 און 3), פּראָפּילאַמינע (2), אָדער בענזילאַמינע (4).מיר באמערקט אַז HEK293T סעלז זיך האָבן אַ העכער הינטערגרונט סיגנאַל קאַמפּערד מיט קיין בלוי ליכט, עפשער רעכט צו דער ענדאָגענאָוס ריבאָפלאַווין פאָטאָסענסיטיזער, פלאַווין מאָנאָנוקלעאָטידע (FMN) 27. אַנילין-באזירט כעמישער פּראָבעס 1 און 3 געגעבן בעסער ספּעסיפיקאַטי, מיט HEK293T סטאַביל יקספּרעסינג מיניסאָג אין מיטאָטשאָנדריאַ ווייַזנדיק אַ> 8-פאַרלייגן פאַרגרעסערן אין סיגנאַל פֿאַר זאָנד 3, בשעת זאָנד 2 געניצט אין די רנאַ-לייבלינג אופֿן CAP-seq בלויז ווייַזנדיק ~ 2.5- פאַרלייגן סיגנאַל פאַרגרעסערן, מסתּמא רעכט צו פאַרשידענע ריאַקטיוואַטי פּרעפֿערענצן צווישן רנאַ און פּראָטעין (Fig. 1b, C). אַנילין-באזירט כעמישער פּראָבעס 1 און 3 געגעבן בעסער ספּעסיפיקאַטי, מיט HEK293T סטאַביל יקספּרעסינג מיניסאָג אין מיטאָטשאָנדריאַ ווייַזנדיק אַ> 8-פאַרלייגן פאַרגרעסערן אין סיגנאַל פֿאַר זאָנד 3, בשעת זאָנד 2 געניצט אין די רנאַ-לייבלינג אופֿן CAP-seq בלויז ווייַזנדיק ~ 2.5- פאַרלייגן סיגנאַל פאַרגרעסערן, מסתּמא רעכט צו פאַרשידענע ריאַקטיוואַטי פּרעפֿערענצן צווישן רנאַ און פּראָטעין (Fig. 1b, C).אַנילין-באזירט כעמישער פּראָבעס 1 און 3 האָבן געוויזן בעסער ספּעסיפיקאַטי: HEK293T, וואָס סטאַביל יקספּרעסאַז מיניסאָג אין מיטאָטשאָנדריאַ, ווייזט מער ווי אַ 8-פאַרלייגן פאַרגרעסערן אין סיגנאַל פֿאַר זאָנד 3, בשעת זאָנד 2, געניצט אין די CAP-seq RNA לייבלינג אופֿן, בלויז ווייזט ~ 2.5-פאַרלייגן סיגנאַל פאַרגרעסערן, מיסטאָמע רעכט צו פאַרשידענע ריאַקטיוואַטי פּרעפֿערענצן צווישן רנאַ און פּראָטעין (Fig. 1b, C).基于 苯胺 的 化学 3 具有 具有 更 好 好 好 好 的 的 线 线 线 线 线 粒体 粒体 粒体 中 中 中 中 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 稳定 的 的 的 的 的 信号 信号 信号 信号, 而 信号 倍 倍 于 于 רנאַ 显示 方法 显示 显示 显示 显示 显示 显示 显示2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）。基于 苯胺 的 化学 1 具有 3 具有 更 更 的 的 的 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 粒体 中 粒体 中 稳定 中 中 稳定 稳定 中 稳定 בנין 表达 3 的 的 信号 信号 信号 增加 而 而 而 而 而 而 于 于 于 而 רנאַ 标记 स-而 而 于 而 而 而 而 而 而 于 רנאַ 于-倍信号增加，可能是由于RNAאַנילין-באזירט כעמישער פּראָבעס 1 און 3 האָבן בעסער ספּעסיפיקאַטי, HEK293T סטאַביל אויסגעדריקט מיניסאָג אין מיטאָטשאָנדריאַ, און זאָנד 3 האט אַ העכער 8-פאַרלייגן פאַרגרעסערן אין סיגנאַל, בשעת זאָנד 2 פֿאַר די CAP-seq RNA לייבלינג אופֿן געוויזן בלויז ~2.5-פאַרלייגן פאַרגרעסערן.אין דער סיגנאַל, מיסטאָמע רעכט צו פאַרשידענע אָפּרוף פּרעפֿערענצן צווישן רנאַ און פּראָטעין (Fig. 1b, C).אין דערצו, זאָנד קסנומקס יסאָמערז און הידראַזין פּראָבעס (פּראָבעס קסנומקס, קסנומקס, קסנומקס) זענען טעסטעד, קאַנפערמינג די אַפּטאַמאַזיישאַן פון זאָנד קסנומקס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. קסנומקסב, C).סימילאַרלי, אין-געל פלואָרעססענסע אַנאַליסיס אנטפלעקט אנדערע אָפּטימיזעד יקספּערמענאַל פּאַראַמעטערס: יריידייישאַן ווייוולענגט (460 נם), כעמיש זאָנד קאַנסאַנטריישאַן (1 מם), און יריידייישאַן צייט (20 מין) (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 אַ-C).אָמיטינג קיין קאָמפּאָנענט אָדער שריט אין די פּדפּל פּראָטאָקאָל ריזאַלטיד אין אַ באַטייטיק סיגנאַל מאַפּאָלע צו דער הינטערגרונט (פיגורע קסנומקסד).נאָוטאַבלי, פּראָטעין לייבלינג איז באטייטיק רידוסט אין דעם בייַזייַן פון סאָדיום אַזידע אָדער טראָלאָקס, וואָס זענען באקאנט צו שטילן סינגלעט זויערשטאָף.די בייַזייַן פון D2O, וואָס איז באַוווסט צו סטייבאַלייז סינגלעט זויערשטאָף, ימפּרוווז די לייבלינג סיגנאַל.צו ויספאָרשן די צושטייַער פון אנדערע ריאַקטיוו זויערשטאָף מינים צו לייבלינג, מאַנניטאָל און וויטאַמין C זענען צוגעגעבן צו פאַרלייגן הידראָקסיל און סופּעראַקסייד ראַדיקאַל סקאַוואַנדזשערז, ריספּעקטיוולי, 18, 29, אָבער זיי זענען נישט געפֿונען צו רעדוצירן די לייבלינג.דערצו פון H2O2, אָבער נישט ילומאַניישאַן, האט נישט רעזולטאַט אין לייבלינג (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3 אַ).פלואָרעססענסע סינגלעט זויערשטאָף ימאַגינג מיט סי-דמאַ פּראָבעס באשטעטיקט די בייַזייַן פון סינגלעט זויערשטאָף אין די HEK293T-miniSOG דראָט, אָבער נישט אין דער אָריגינעל HEK293T דראָט.אין דערצו, מיטאָסאָקס רעד קען נישט דעטעקט סופּעראַקסייד פּראָדוקציע נאָך ילומאַניישאַן (Fig. 1e און סאַפּלאַמענערי פייג. 3b) 30. די דאַטן שטארק פֿאָרשלאָגן אַז סינגלעט זויערשטאָף איז די הויפּט ריאַקטיוו זויערשטאָף מינים פאַראַנטוואָרטלעך פֿאַר סאַבסאַקוואַנט פּראָטעאָמיק לייבלינג.סיטאָטאָקסיסיטי פון פּדפּל איז אַססעססעד אַרייַנגערעכנט בלוי ליכט יריידייישאַן און כעמיש פּראָבעס, און קיין באַטייטיק סיטאָטאָקסיסיטי איז באמערקט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 אַ).
אין סדר צו לערנען די לייבלינג מעקאַניזאַם און געבן פּראָטעאָמיק לעגיטימאַציע פון ​​פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז מיט LC-MS / MS, מיר ערשטער דאַרפֿן צו באַשליסן וואָס אַמינאָ אַסאַדז זענען מאַדאַפייד און די דעלטאַ מאַסע פון ​​זאָנד לאַבעלס.מעטהיאָנינע, היסטידינע, טריפּטאָפאַן און טיראָסינע זענען רעפּאָרטעד צו זיין מאַדאַפייד דורך סינגלעט זויערשטאָף14,15.מיר ויסשטימען די TOP-ABPP31 וואָרקפלאָוו מיט די אַנבייאַסט עפענען זוכן צוגעשטעלט דורך די FragPipe קאַמפּיוטינג פּלאַטפאָרמע באזירט אויף MSFragger32.נאָך מאָדיפיקאַטיאָן פון סינגלעט זויערשטאָף און כעמישער זאָנד לייבלינג, גיט כעמיע איז דורכגעקאָכט מיט אַ ביאָטין רעדוקציע פירמע מיט אַ קלעאַוואַבלע לינקער, נאכגעגאנגען דורך נעוטראַווידין סטרעטשינג און טריפּסין דיידזשעסטשאַן.די מאַדאַפייד פּעפּטייד, נאָך געבונדן צו די סמאָלע, איז פאָטאָקלעאַוועד פֿאַר LC-MS / MS אַנאַליסיס (פיגורע 2 אַ און סאַפּלאַמענערי דאַטאַ 1).א גרויס נומער פון מאָדיפיקאַטיאָנס פארגעקומען איבער די פּראָטעאָמע מיט איבער 50 פּעפּטייד מאַפּע (PSM) שוועבעלעך ליסטעד (Fig. 2b).סאַפּרייזינגלי, מיר נאָר באמערקט מאָדיפיקאַטיאָן פון היסטידינע, מיסטאָמע רעכט צו דער העכער ריאַקטיוואַטי פון אַקסאַדייזד היסטידינע צו אַנילין פּראָבעס ווי אנדערע אַמינאָ אַסאַדז.לויט די ארויס מעקאַניזאַם פון היסטידינע אַקסאַדיישאַן דורך סינגלעט זויערשטאָף, 21,33 די פארגעלייגט דעלטאַ-מאַסע סטרוקטור פון +229 דאַ קאָראַספּאַנדז צו די אַדדוקט פון זאָנד 3 מיט 2-אָקסאָ-היסטידינע נאָך צוויי אַקסאַדיישאַנז, בשעת +247 דאַ איז די כיידראַלאַסאַס פּראָדוקט פון +229 דאַ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 5).די אפשאצונג פון די MS2 ספּעקטרום געוויזן אַ הויך רילייאַבילאַטי פון לעגיטימאַציע פון ​​רובֿ פון די י און ב ייאַנז, אַרייַנגערעכנט די לעגיטימאַציע פון ​​מאַדאַפייד פראַגמענט ייאַנז (י און ב) (Fig. 2c).קאָנטעקסט אַנאַליסיס פון די היגע סיקוואַנס פון פּדפּל-מאַדאַפייד כיסטידינעס אנטפלעקט אַ מעסיק מאָטיף ייבערהאַנט פֿאַר קליין כיידראָופאָביק רעזאַדוז ביי ± 1 שטעלעס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 ב).אין דורכשניטלעך, 1.4 היסטידינעס זענען יידענאַפייד פּער פּראָטעין, און די זייטלעך פון די מאַרקערס זענען באשלאסן דורך סאַלוואַנט צוטריטלעך ייבערפלאַך געגנט (סאַסאַ) און קאָרעוו סאַלוואַנט אַוויילאַביליטי (רסאַ) אַנאַליסיס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 ק, ד).
אַן אַנבייאַסט וואָרקפלאָוו פֿאַר לערנען ריזידזשואַל סעלעקטיוויטי ניצן די FragPipe קאַמפּיוטינג פּלאַטפאָרמע פּאַוערד דורך MSFragger.קלעאַוואַבלע לינקערס זענען געניצט אין קליק כעמיע צו לאָזן פאָטאָקלעאַוואַגע פון ​​מאַדאַפייד פּעפּטיידז פֿון סטרעפּטאַווידין סמאָלע.אַן אָפֿן זוכן איז לאָנטשט צו ידענטיפיצירן פילע מאָדיפיקאַטיאָנס, ווי געזונט ווי באַטייַטיק רעמנאַנץ.ב באַשטימען די מאַסע פון ​​מאָדיפיקאַטיאָנס וואָס פאַלן איבער די פּראָטעאָמע.פּעפּטייד מאַפּינג PSM.c MS2 ספּעקטראַל אַנאַטיישאַן פון היסטידינע זייטלעך מאַדאַפייד מיט זאָנד 3. ווי אַ רעפּריזענאַטיוו בייַשפּיל, אַ קאָוואַלענט אָפּרוף מיט זאָנד 3 צוגעגעבן +229.0938 דאַ צו די מאַדאַפייד אַמינאָ זויער.ד מוטיישאַן אַסייַי געניצט צו פּרובירן פֿאַר PDPL מאַרקערס.PRDX3 (H155A, H225A) און PRDX1 (H10A, H81A, H169A) זענען טראַנספעקטעד מיט ווילד-טיפּ פּלאַסמיידז פֿאַר אַנטי-פלאַג דיטעקשאַן.e די סינטעטיש פּעפּטייד איז ריאַקטאַד מיט פּיוראַפייד מיניסאָג אין דעם בייַזייַן פון זאָנד 3 און די קאָראַספּאַנדינג פּראָדוקטן מיט Δm +247 און +229 זענען באמערקט אין די LC-MS ספּעקטרום.ף ינ וויטראָ פּראָטעין-צו-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז מאָדעלעד מיט מיניסאָג-6קסהיס-קוויטל און אַנטי-6קסהיס אַנטיבאָדי.אַנטיביאָטין (סטרעפּטאַווידין-הרפּ) און אַנטי-מויז מערב בלאָט אַנאַליסיס פון מיניסאָג-6קסהיס / אַנטי-6קסהיס אַנטיבאָדי קאַמפּלעקסאַז מיט זאָנד 3, דיפּענדינג אויף די צייט פון ויסשטעלן צו ליכט.לאַבעלס פֿאַר יחיד פּראָטעינס זענען אויסגעדריקט אין די קאָראַספּאַנדינג מאָלעקולאַר וואָג: לק אַנטיבאָדי ליכט קייט, HC אַנטיבאָדי שווער קייט.די יקספּעראַמאַנץ זענען ינדיפּענדאַנטלי ריפּיטיד בייַ מינדסטער צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן.
פֿאַר בייאָוקעמיקאַל וועראַפאַקיישאַן פון די לייבלינג פּלאַץ, PRDX3 און PRDX1 יידענאַפייד דורך מאַסע ספּעקטראָמעטרי זענען טשיינדזשד פון היסטידינע צו אַלאַנינע און קאַמפּערד מיט ווילד טיפּ אין טראַנספעקשאַן אַסייס.די פּדפּל רעזולטאַטן געוויזן אַז די מיוטיישאַן באטייטיק רידוסט לייבלינג (Fig. 2 ד).דערווייַל, די פּעפּטייד סיקוואַנסיז יידענאַפייד אין די עפענען זוכן זענען סינטאַסייזד און ריאַקטאַד אין וויטראָ מיט פּיוראַפייד מיניסאָג אין דעם בייַזייַן פון זאָנד 3 און בלוי ליכט, וואָס געבן פּראָדוקטן מיט אַ מאַסע יבעררוק פון +247 און +229 דאַ ווען דיטעקטאַד דורך LC-MS (Fig. 2ע).).צו פּרובירן צי ינטעראַקטינג פּראַקסימאַל פּראָטעינס קען זיין לייבאַלד אין וויטראָ אין ענטפער צו מיניסאָג פאָטאָאַקטיוואַטיאָן, מיר דיזיינד אַ קינסטלעך פּראַקסימאַטי אַססייַ דורך ינטעראַקשאַן צווישן די miniSOG-6xHis פּראָטעין און אַן אַנטי-זיין מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי אין וויטראָ (פיגורע 2f).אין דעם אַסיי, מיר דערוואַרט פּראַקסימאַל לייבלינג פון אַנטיבאָדי שווער און ליכט קייטן מיט מיניסאָג.אין פאַקט, אַנטי-מויז (דערקענען די שווער און ליכט קייטן פון אַנטי-6קסהיס-לייבאַלד אַנטיבאָדי) און סטרעפּטאַווידין מערב בלאַץ געוויזן שטאַרק ביאָטינילאַטיאָן פון די שווער און ליכט קייטן.נאָוטאַבלי, מיר באמערקט מיניסאָג אַוטאָביאָטינילאַטיאָן רעכט צו דער 6xHis קוויטל און קרייַז-לינקס צווישן ליכט און שווער קייטן, וואָס קען זיין שייַכות צו די פריער דיסקרייבד ריס צווישן ליסין און 2-אָקסאָ-היסטידינע פּראַקסימאַל ענטפער.אין מסקנא, מיר פאַרענדיקן אַז PDPL מאַדאַפייז היסטידינע אין אַ פּראַקסימאַטי אָפענגיק שטייגער.
אונדזער ווייַטער ציל איז געווען צו קעראַקטערייז די סובסעללולאַר פּראָטעאָמע צו פּרובירן די ספּעציפֿישקייט פון אין סיטו לייבלינג.דעריבער, מיר סטאַביל אויסגעדריקט מיניסאָג אין די קערן, מיטאָטשאָנדריאַל מאַטריץ אָדער ויסווייניקסט ער מעמבראַנע פון ​​HEK293T סעלז (Fig. 3a).געל פלורעסאַנס אַנאַליסיס אנטפלעקט שעפעדיק לייבאַלד באַנדס אין דרייַ סובסעללולאַר לאָוקיישאַנז ווי געזונט ווי פאַרשידענע לייבלינג פּאַטערנז (Fig. 3b).פלואָרעססענסע ימאַגינג אַנאַליסיס געוויזן הויך ספּעסיפיקאַטי פון פּדפּל (Fig. 3c).די PDPL וואָרקפלאָוו איז נאכגעגאנגען דורך קליקינג ריאַקשאַנז מיט רהאָדאַמינע דיעס צו דעלינירן סובסעללולאַר פּראָטעאָמעס ניצן פלורעסאַנס מיקראָסקאָפּי, און PDPL סיגנאַלז זענען קאָלאָקאַליזעד מיט DAPI, מיטאָטשאָנדריאַל טראַקערז אָדער ער טראַקערז, קאַנפערמינג די הויך פאַדעלאַטי פון PDPL.פֿאַר די דריי אָרגאַנעל לאָוקיישאַנז, אַ זייַט-ביי-זייַט פאַרגלייַך פון PDPL מיט טורבאָיד ניצן אַווידין מערב בלאָט געוויזן אַז PDPL איז געווען לייבאַלד מער ספּאַסיפיקלי קאַמפּערד מיט זייער ריספּעקטיוו קאָנטראָלס.אונטער פּדפּל טנאָים, מער לייבאַלד באַנדס ארויס, ינדאַקייטינג מער פּדפּל-לייבאַלד פּראָטעינס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 6 אַ-ד).
אַ סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון מיניסאָג-מעדיאַטעד אָרגאַנעל-ספּעציפיש פּראָטעאָמע לייבלינג.miniSOG טאַרגאַץ די מיטאָטשאָנדריאַל מאַטריץ דורך פוסיאָן צו די N-וואָקזאַל 23 אַמינאָ אַסאַדז פון מענטשלעך COX4 (mito-miniSOG), די קערן דורך פוסיאָן צו H2B (נוקלעוס-miniSOG), און Sec61β דורך די סיטאָפּלאַסמיק זייַט פון די ער מעמבראַנע (ER-miniSOG) ).ינדיקאַטיאָנס אַרייַננעמען געל ימאַגינג, קאָנפאָקאַל ימאַגינג און מאַסע ספּעקטראָמעטרי.ב רעפּרעסענטאַטיווע געל בילדער פון דריי אָרגאַנעל-ספּעציפיש פּדפּל פּראָופיילז.CBB Coomassie Brilliant Blue.c רעפּריזענאַטיוו קאָנפאָקאַל בילדער פון HEK293T סעלז סטאַביל יקספּרעסינג מיניסאָג מיט פאַרשידענע סובסעללולאַר לאָוקאַלאַזיישאַנז דיטעקטאַד דורך אַנטיבאָדי מיטן נאָמען V5 (רויט).סובסעללולאַר מאַרקערס זענען געניצט פֿאַר מיטאָטשאָנדריאַ און ער (גרין).די PDPL וואָרקפלאָוו כולל די דיטעקשאַן פון מיניסאָג (געל) מיטן נאָמען סובסעללולאַר פּראָטעאָמעס ניצן Cy3-אַזידע גיט כעמיע.וואָג באַר: 10 μם.ד וואַלקאַניק פּלאַץ פון פּדפּל-טאַגד פּראָטעאָמעס אין פאַרשידן אָרגאַנאַלז קוואַנטאַפייד דורך אַנלייבאַלד קוואַנטאַפאַקיישאַן (n = 3 פרייַ בייאַלאַדזשיקאַל יקספּעראַמאַנץ).צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן איז געניצט אויף ווולקאַן פּלאַץ.HEK293T ווילד טיפּ איז געניצט ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל. באטייטיק געביטן פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי חילוק). באטייטיק געביטן פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי חילוק). ינטענסיטי קאַנסאַנטריישאַן פון די קאַנסאַנטריישאַן פון געלט (פּ < 0,05 און > 2-קראָפּ אין אינטערנאציאנאלע יאָס). באטייטיק אָלטערד פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן חילוק אין יאָן ינטענסיטי).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 ניט-רעקווירעמענץ (פּ < 0,05 און > 2-קראָטנייַאַ רעזידענטשאַל אין יאָננאָי סיליע). באטייטיק אָלטערד פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן חילוק אין ייאַניק שטאַרקייַט).פֿאַרבונדענע פּראָטעינס וויכטיק פֿאַר HEK293T-miniSOG אָבער נישט וויכטיק פֿאַר HEK293T זענען געוויזן אין גרין.E אַנאַליסיס פון די ספּעציפֿישקייט פון פּראָטעאָמיק דאַטאַסעץ פון יקספּעראַמאַנץ ד.די גאַנץ נומער פון סטאַטיסטיש באַטייַטיק פּראָטעינס אין יעדער אָרגאַנעל (רויט און גרין דאַץ) איז אנגעצייכנט אין די שפּיץ.היסטאָגראַמס ווייַזן פּראָטעינס לאָוקאַלייזד אין אָרגאַנאַלז באזירט אויף מיטאָקאַרטאַ 3.0, GO אַנאַליסיס און יי טינג עט על.מענטשן.באַזונדער דאַטאַסעץ פֿאַר מיטאָטשאָנדריאַ, נוקליי און ער.די יקספּעראַמאַנץ זענען ינדיפּענדאַנטלי ריפּיטיד בייַ מינדסטער צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן.רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.
ינקעראַדזשד דורך די געל און ימאַגינג רעזולטאַטן, פירמע-פריי קוואַנטאַפאַקיישאַן איז געניצט צו קוואַנטיפיקירן די יידענאַפייד פּראָטעאָמע אין יעדער אָרגאַנעל (סופּפּלעמענטאַרי דאַטאַ 2).ונטראַנספעקטעד HEK293T איז געניצט ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל צו אַראָפּרעכענען הינטערגרונט מאַרקערס. ווולקאַן פּלאַנעווען אַנאַליסיס געוויזן באטייטיק ענריטשט פּראָטעינס (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי) ווי געזונט ווי סינגלעטאָן פּראָטעינס וואָס זענען בלויז פאָרשטעלן אין מיניסאָג-יקספּרעסינג שורות (Fig. 3 ד רויט און גרין דאַץ). ווולקאַן פּלאַנעווען אַנאַליסיס געוויזן באטייטיק ענריטשט פּראָטעינס (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי) ווי געזונט ווי סינגלעטאָן פּראָטעינס וואָס זענען בלויז פאָרשטעלן אין מיניסאָג-יקספּרעסינג שורות (Fig. 3 ד רויט און גרין דאַץ). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). ווולקאַן פּלאַנעווען אַנאַליסיס געוויזן באטייטיק ענריטשט פּראָטעינס (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי) ווי געזונט ווי איין פּראָטעינס וואָס זענען בלויז פאָרשטעלן אין מיניסאָג-יקספּרעסינג שורות (Fig. 3 ד, רויט און גרין דאַץ).火山图 分析 显示 出 显着 富集 的 (פּ <0.05 和> 2 倍 离子 离子) 以及 仅 仅 仅 存 存 存 MENISOG 表达 系 中 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一 单一火山图 分析 显示 出 显着 的 (פּ <0.05 和> 2 倍倍 离子 离子 离子) 仅 存 存 存 在于 在于 MINISOG 表达 系 的 单一 单一 单一 (图 3 ד 绿色点 ...)))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). ווולקאַן פּלאַנעווען אַנאַליסיס אנטפלעקט באטייטיק ענריטשט פּראָטעינס (פּ <0.05 און> 2 קס ייאַניק שטאַרקייַט) ווי געזונט ווי איין פּראָטעינס בלויז פאָרשטעלן אין די מיניסאָג אויסדרוק שורה (רויט און גרין דאַץ אין פייג. 3 ד).קאַמביינינג די דאַטן, מיר יידענאַפייד 1364, 461 און 911 סטאַטיסטיש באַטייַטיק יאָדער, מיטאָטשאָנדריאַל און ער ויסווייניקסט מעמבראַנע פּראָטעינס ריספּעקטיוולי.צו אַנאַלייז די אַקיעראַסי פון אָרגאַנעל-לאָוקאַלייזד פּדפּל, מיר געוויינט MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) אַנאַליסיס, און A. Ting et al.אַ דאַטן סעט8 איז געניצט פֿאַר מיטאָטשאָנדריאַ, קערן און ער צו פּרובירן די אָרגאַנעל ספּעסיפיקייט פון די דיטעקטאַד פּראָטעינס, קאָראַספּאַנדינג צו אַ אַקיעראַסי פון 73.4, 78.5, און 73.0% (Fig. 3e).די ספּעציפֿישקייט פון PDPL קאַנפערמז אַז PDPL איז אַן אידעאל געצייַג צו ידענטיפיצירן אָרגאַנעל-ספּעציפיש פּראָטעאָמעס.נאָוטאַבלי, סאַבמיטאָטשאָנדריאַל אַנאַליסיס פון יידענאַפייד מיטאָטשאָנדריאַל פּראָטעינס געוויזן אַז די טראַפּט פּראָטעאָמע איז דער הויפּט פונאנדערגעטיילט אין די מאַטריץ און ינער מעמבראַנע (226 און 106, ריספּעקטיוולי), אַקאַונטינג פֿאַר 91.7% (362) פון די גאַנץ נומער פון יידענאַפייד מיטאָטשאָנדריאַל פּראָטעינס.אַ הויך מדרגה פון פּדפּל איז אויך באשטעטיקט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7 אַ).סימילאַרלי, סובנוקלעאַר אַנאַליסיס געוויזן אַז די קאַפּטשערד פּראָטעאָמע איז דער הויפּט פונאנדערגעטיילט אין די קערן, נוקלעאָפּלאַסם און נוקלעאָלוס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7 ב).יאָדער פּראָטעאָמיק אַנאַליסיס מיט אַ יאָדער לאָוקאַלאַזיישאַן סיגנאַל פּעפּטייד (קסנומקסקסנלס) געוויזן ענלעך אַקיעראַסי צו די הקסנומקסב בויען (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 7ק-ה).צו באַשטימען די ספּעציפֿישקייט פון די PDPL מאַרקער, יאָדער לאַמינין א איז אויסדערוויילט ווי אַ מער דיסקרעטעלי לאָוקאַלייזד POI7 טראַפּ.PDPL יידענאַפייד 36 באטייטיק ענריטשט פּראָטעינס, פון וואָס 12 פּראָטעינס (30.0% אַרייַנגערעכנט לאַמין א) זענען געזונט קעראַקטערייזד לאַמין א ינטעראַקטינג פּראָטעינס אַנאַטייטיד דורך די סטרינג דאַטאַבייס, מיט אַ העכער פּראָצענט ווי די BioID אופֿן (122 פּראָטעינס) 28 פון 28. , 22.9 %) 7. אונדזער אופֿן יידענאַפייד ווייניקערע פּראָטעינס, עפשער רעכט צו לימיטעד לייבלינג געביטן, וואָס איז געווען מעגלעך דורך מער אַקטיוו סינגלעט זויערשטאָף.GO אַנאַליסיס געוויזן אַז די יידענאַפייד פּראָטעינס זענען דער הויפּט ליגן אין די נוקלעאָפּלאַסם (26), יאָדער מעמבראַנע (10), יאָדער מעמבראַנע (9), און יאָדער פּאָרעס (5).קאַלעקטיוולי, די יאָדער-לאָוקאַלייזד פּראָטעינס אַקאַונאַד פֿאַר 80% פון די ענריטשט פּראָטעינס, ווייַטער דעמאַנסטרייטינג די ספּעסיפיסיטי פון פּדפּל (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 8 אַ-ד).
נאָך געגרינדעט די פיייקייט פון PDPL צו דורכפירן פּראַקסימאַטי מאַרקינג אין אָרגאַנאַלז, מיר דעמאָלט טעסטעד צי PDPL קען זיין געוויינט צו אַנאַלייז POI ביינדינג פּאַרטנערס.אין באַזונדער, מיר געזוכט צו דעפינירן PDPL אַנאַליסיס פון סיטאָסאָליק פּראָטעינס, וואָס זענען געהאלטן מער שווער טאַרגאַץ ווי זייער מעמבראַנע-לאָוקאַלייזד קאַונערפּאַרץ רעכט צו זייער העכסט דינאַמיש נאַטור.די בראָדאָמאַין און עקסטראַטערמינאַל (BET) פּראָטעין ברד4 האט געצויגן אונדזער ופמערקזאַמקייט פֿאַר זייַן שליסל ראָלע אין פאַרשידן חולאתן 35, 36.די קאָמפּלעקס געשאפן דורך BRD4 איז אַ טראַנסקריפּטיאָנאַל קאָאַקטיוואַטאָר און אַ וויכטיק טעראַפּיוטיק ציל.דורך רעגיאַלייטינג די אויסדרוק פון c-myc און Wnt5a טראַנסקריפּציע סיבות, BRD4 איז געדאַנק צו זיין אַ שליסל דיטערמאַנאַנט פון אַקוטע מיעלאָיד לוקימיאַ (AML), קייפל מיעלאָמאַ, בורקיטט לימפאָמאַ, צווייפּינטל ראַק און ינפלאַמאַטאָרי חולאתן37,38.אין אַדישאַן, עטלעכע ווירוסעס ציל BRD4 צו רעגולירן וויראַל און סעליאַלער טראַנסקריפּציע, אַזאַ ווי פּאַפּיללאָמאַווירוס, היוו און סאַרס-קאָוו -236,39.
צו מאַפּע די BRD4 ינטעראַקשאַן מיט PDPL, מיר קאַמביינד מיניסאָג מיט אַ קורץ N- אָדער C-וואָקזאַל יסאָפאָרם פון BRD4.פּראָטעאָמיק רעזולטאטן אנטפלעקט אַ הויך גראַד פון אָוווערלאַפּ צווישן די צוויי קאַנסטראַקשאַנז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 9 אַ).די יאָדער פּראָטעאָמע יידענאַפייד מיט מיניסאָג-ה2ב קאָווערס 77.6% פון די פּראָטעינס ינטעראַקטינג מיט ברד4 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 9ב).דערנאָך, פאַרשידענע צייט פון ילומאַניישאַן (2, 5, 10, 20 מין) זענען געניצט צו סטרויערן די מאַרקער ראַדיוס (Fig. 4 אַ און סאַפּלאַמענערי דאַטן 3).מיר פאַרענדיקן אַז ביי קירצער פאָטאָפּיריאָדס, PDPL וועט בפֿרט לייבלינג דירעקט ביינדינג פּאַרטנערס, בשעת מער פּיריאַדז וועט אַרייַננעמען פּראָטעינס יידענאַפייד בעשאַס קירצער פאָטאָאַקטיוואַטיאָן פּיריאַדז און ומדירעקט טאַרגאַץ אין לייבלינג קאַמפּלעקסאַז.אין פאַקט, מיר געפֿונען שטאַרק אָוווערלאַפּ צווישן שכייניש צייט ווייזט (84.6% פֿאַר 2 און 5 מין; 87.7% פֿאַר 5 און 10 מין; 98.7% פֿאַר 10 און 20 מין) (Fig. 4b און Supplementary Fig. 9c).אין אַלע יקספּערמענאַל גרופּעס, מיר געפֿונען ניט בלויז BRD4 זיך-לייבעלינג, אָבער עטלעכע באַוווסט טאַרגאַץ אַזאַ ווי MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A און HMGB1 אַנאַטייטיד אין די שטריקל דאַטאַבייס.די ייאַניק שטאַרקייַט פון די טאַרגאַץ איז פּראַפּאָרשאַנאַל צו די ויסשטעלן צייַט (פיגורע 4 ק און סאַפּלאַמענערי פייג 9 ד).GO אַנאַליסיס פון די פּראָטעינס יידענאַפייד אין די 2-מינוט גרופּע געוויזן אַז די יידענאַפייד פּראָטעינס זענען לאָוקאַלייזד אין די קערן און זענען ינוואַלווד אין טשראָמאַטין רימאַדלינג און רנאַ פּאָלימעראַסע פונקציע.די מאָלעקולאַר פֿונקציע פון ​​דעם פּראָטעין איז ענריטשט אין טשראָמאַטין ביינדינג אָדער טראַנסקריפּטיאָנאַל קאָאַקטיוואַטיאָן, קאָנסיסטענט מיט ברד4 פֿונקציע (Fig. 4 ד).שטריקל דאַטאַבייס-ענייבאַלד פּראָטעין ינטעראַקשאַן אַנאַליסיס אנטפלעקט אַ ערשטער מדרגה פון ומדירעקט ינטעראַקשאַנז צווישן ברד4 און הדאַק משפּחה ינטעראַקטינג קאַמפּלעקסאַז אַזאַ ווי SIN3A, NCOR2, BCOR, און SAP130 (Fig. 4e און Supplementary Fig. 9e), קאָנסיסטענט מיט ברד4 און הדאַק ביינדינג אַסעטילאַטעד היסטאָנעס ..אין דערצו, רעפּריזענאַטיוו טאַרגאַץ יידענאַפייד דורך LC-MS / MS, אַרייַנגערעכנט Sin3A, NSUN2, Fus, און SFPQ, זענען באשטעטיקט דורך מערב בלאָטינג (Fig. 4f).לעצטנס, די קורץ יסאָפאָרם פון BRD4 איז רעפּאָרטעד צו פאָרעם נוקליי מיט פליסיק-פליסיק פאַסע צעשיידונג (LLPS) פּראָפּערטיעס.די RNA ביינדינג פּראָטעינס Fus און SFPQ פאַרמיטלען די LLPS פון פאַרשידן סעליאַלער פּראַסעסאַז און האָבן שוין יידענאַפייד דאָ ווי אַנרעקאָרדעד BRD4 ביינדינג פּראָטעינס.די ינטעראַקשאַן צווישן BRD4 און SFPQ איז באשטעטיקט דורך קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן (קאָ-IP) יקספּעראַמאַנץ (פיגורע 4g), סאַגדזשעסטינג אן אנדער מעקאַניזאַם פֿאַר BRD4-מעדיאַטעד פליסיק-פליסיק פאַסע צעשיידונג דיזערווינג ווייַטער ויספאָרשונג.צוזאַמען, די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז PDPL איז אַן אידעאל פּלאַטפאָרמע פֿאַר ידענטיפיינג באַוווסט BRD4 ינטעראַקטינג און אומבאַקאַנט ביינדינג פּראָטעינס.
אַ סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון מיניסאָג-מעדיאַטעד BRD4 פּראַקסימאַטי מאַרקינג, ויסשטעלן צייט: 2, 5, 10 און 20 מינוט.ב אָוווערלאַפּ פון פּראָטעינס יידענאַפייד אין פאַרשידענע ילומאַניישאַן צייט.פּראָטעין ענריטשמענט יידענאַפייד אין HEK293T-miniSOG-BRD4 איז געווען סטאַטיסטיש באַטייטיק קאַמפּערד מיט ווילד טיפּ HEK293T.C יאָן ינטענסיטי ווען קוואַנטיפיינג אַנלאַבעלעד פארשטייער באַוווסט ברד4-ביינדינג פּראָטעינס בעשאַס די ספּעסיפיעד ויסשטעלן צייט.n = 3 בייאַלאַדזשיקלי פרייַ סאַמפּאַלז.דאַטן זענען דערלאנגט ווי דורכשניטלעך ± נאָרמאַל דיווייישאַן.ד גענע אָנטאָלאָגיקאַל אַנאַליסיס (GO) פון פּראָטעינס יידענאַפייד אין די 2-מינוט גרופּע.די ערשטע צען GO טערמינען זענען ליסטעד.באַבאַלז זענען בונט לויט די GO טערמין קאַטעגאָריע, און בלאָז גרייס איז פּראַפּאָרשאַנאַל צו די נומער פון פּראָטעינס געפֿונען אין יעדער טערמין.E שטריקל אַנאַליסיס פון פּראָטעינס ינטעראַקטינג מיט BRD4.די געל קרייזן זענען דירעקט קליי און די גרוי קרייזן זענען דער ערשטער שיכטע פון ​​ומדירעקט קליי.די רויט שורות פאָרשטעלן די יקספּערמענאַלי באשלאסן ינטעראַקשאַנז און די בלוי שורות פאָרשטעלן די פּרעדיקטעד ינטעראַקשאַנז.ף רעפּריזענאַטיוו ברד 4 ביינדינג טאַרגאַץ יידענאַפייד אין LC-MS / MS זענען וועראַפייד דורך מערב בלאָטינג.ג קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן יקספּעראַמאַנץ באַשטעטיקן די ינטעראַקשאַן צווישן SFPQ און BRD4.די יקספּעראַמאַנץ זענען ינדיפּענדאַנטלי ריפּיטיד בייַ מינדסטער צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן.רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.
אין אַדישאַן צו ידענטיפיצירן אַנרעדזשיסטערד פּאָי-פארבונדן טאַרגאַץ, מיר כייפּאַטייזיז אַז PDPL וועט זיין פּאַסיק פֿאַר ידענטיפיינג סאַבסטרייץ פֿאַר ענזימעס, וואָס וואָלט דאַרפן די כאַראַקטעריזיישאַן פון ומדירעקט ביינדינג פּראָטעינס אין גרויס קאַמפּלעקסאַז צו אַנאַטייט אַנרעדזשיסטערד סאַבסטרייץ.פּאַרקין (קאָדעד דורך PARK2) איז אַן E3 ליגאַסע און מיוטיישאַנז אין פּאַרקין זענען באקאנט צו פאַרשאַפן אַוטאָסאָמאַל רעסעסיוו דזשוווענילע פּאַרקינסאָן ס קרענק (AR-JP)42.אין אַדישאַן, פּאַרקין איז דיסקרייבד ווי יקערדיק פֿאַר מיטאָפאַגי (מיטאָטשאָנדריאַל אַוטאָפאַגי) און באַזייַטיקונג פון ריאַקטיוו זויערשטאָף מינים.אָבער, כאָטש עטלעכע פּאַרקין סאַבסטרייץ האָבן שוין יידענאַפייד, די ראָלע פון ​​פּאַרקין אין דעם קרענק בלייבט ומקלאָר.צו אַנאַטייט זיין אַנקאַראַקטערייזד סאַבסטרייץ, PDPL איז טעסטעד דורך אַדינג מיניסאָג צו די N- אָדער C-טערמינוס פון פּאַרקין.סעלז זענען באהאנדלט מיט די קאַרבאָניל סייאַנייד פּראָטאָן טראַנספּאָרטער מ-טשלאָראָפענילהידראַזאָנע (קקפּ) צו אַקטאַווייט פּאַרקין דורך די PINK1-Parkin פּאַטוויי.קאַמפּערד צו אונדזער BRD4 PDPL רעזולטאַטן, Parkin N-terminus Fusion אנטפלעקט אַ גרעסערע גאַנג פון ציל פּראָטעינס, כאָטש עס באדעקט אַ גרעסערע חלק פון די C-טערמינוס (177 פון 210) (פיגורע 5 אַ, ב און סאַפּלאַמענערי דאַטאַ 4).דער רעזולטאַט איז קאָנסיסטענט מיט ריפּאָרץ אַז N-וואָקזאַל טאַגס קענען אַבערראַנטלי אַקטאַווייט Parkin44.סאַפּרייזינגלי, עס זענען בלויז 18 אָוווערלאַפּינג פּראָטעינס אין אונדזער דאַטן מיט ארויס AP-MS רעזולטאַטן פֿאַר Parkin43, מסתּמא רעכט צו דיפעראַנסיז צווישן צעל שורות און פּראָטעאָמיקס וואָרקפלאָוז.אין אַדישאַן צו פיר באַוווסט פּראָטעינס (ARDM1, HSPA8, PSMD14 און PSMC3) יידענאַפייד דורך צוויי מעטהאָדס (Fig. 5c)43.צו ווייַטער וואַלאַדייט די רעזולטאַטן פון LC-MS / MS, PDPL באַהאַנדלונג און סאַבסאַקוואַנט מערב בלאָטינג זענען געניצט צו פאַרגלייַכן די רעזולטאַטן פון די HEK293T פאָטער צעל אַסיי און די סטאַביל N-וואָקזאַל פּאַרקין שורה.ביז אַהער אומבאַקאַנט טאַרגאַץ CDK2, DUT, CTBP1 און PSMC4 זענען טעסטעד מיט אַ באַוווסט בינדער, DNAJB1 (Fig. 5d).
ווולקאַן פּלאַנעווען פון פּאַרקין-ינטעראַקטינג פּראָטעינס אין HEK293T סעלז מיט סטאַביל אויסגעדריקט מיניסאָג פיוזד צו די N- אָדער C-טערמינוס פון פּאַרקין (n = 3 פרייַ בייאַלאַדזשיקאַל יקספּעראַמאַנץ).צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן איז געניצט אויף ווולקאַן פּלאַץ.HEK293T איז געניצט ווי אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל. באטייטיק געביטן פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי חילוק). באטייטיק געביטן פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן יאָן ינטענסיטי חילוק). ינטענסיטי קאַנסאַנטריישאַן פון די קאַנסאַנטריישאַן פון געלט (פּ < 0,05 און > 2-קראָפּ אין אינטערנאציאנאלע יאָס). באטייטיק אָלטערד פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן חילוק אין יאָן ינטענסיטי).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和> 2 ניט-רעקווירעמענץ (פּ < 0,05 און > 2-קראָטנייַאַ רעזידענטשאַל אין יאָננאָי סיליע). באטייטיק אָלטערד פּראָטעינס זענען כיילייטיד אין רויט (פּ <0.05 און> 2-פאַרלייגן חילוק אין ייאַניק שטאַרקייַט).פֿאַרבונדענע פּראָטעינס וויכטיק פֿאַר HEK293T-miniSOG אָבער נישט וויכטיק פֿאַר HEK293T זענען געוויזן אין גרין.b Venn דיאַגראַמע ווייזונג אָוווערלאַפּינג פּראָטעינס צווישן N-וואָקזאַל און C-וואָקזאַל קאַנסטראַקשאַנז.N-וואָקזאַל טאַגס קענען אַבערראַנטלי אַקטאַווייט פּאַרקין און רעזולטאַט אין מער רעקאַגנייזאַבאַל פּראָטעינס.c Venn דיאַגראַמע ווייזונג אָוווערלאַפּינג פּראָטעינס צווישן PDPL און AP-MS.באַוווסט ינטעראַקטערז זענען ליסטעד, אַרייַנגערעכנט 4 פון 18 אָוווערלאַפּינג פּראָטעינס און 11 פון 159 פּראָטעינס ספּאַסיפיקלי יידענאַפייד אין PDPL.ד רעפּרעסענטאַטיווע טאַרגאַץ יידענאַפייד דורך LC-MS / MS זענען וועראַפייד דורך מערב בלאָטינג.e Ssu72 און SNW1 זענען יידענאַפייד ווי אַנרעדזשיסטערד פּאַרקין סאַבסטרייץ.די FLAG-טאַגד פּראָטעין פּלאַסמיידז זענען טראַנספעקטעד אין HEK293T און HEK293T-Parkin-miniSOG נאכגעגאנגען דורך CCCP באַהאַנדלונג אין פאַרשידן צייט פונקטן.די דערנידעריקונג איז געווען מער פּראַנאַונסט אין די פּאַרקין אָוווערעקספּרעססיאָן שורה.מיט די פּראָטעאַסאָמע ינכיבאַטער MG132, עס איז געווען באשטעטיקט אַז די דערנידעריקונג פּראָצעס פון Ssu72 און SNW1 איז מידיייטיד דורך פּראָטעאַסאָמע-וביקוויטינאַטיאָן.די יקספּעראַמאַנץ זענען ינדיפּענדאַנטלי ריפּיטיד בייַ מינדסטער צוויי מאָל מיט ענלעך רעזולטאַטן.רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.
נאָוטאַבלי, די פּראָטעינס יידענאַפייד דורך PDPL מוזן אַרייַננעמען פּאַרקין-ביינדינג פּראָטעינס און זייער סאַבסטרייץ.צו דעטעקט אַנרעדזשיסטערד פּאַרקין סאַבסטרייץ, מיר סעלעקטעד זיבן יידענאַפייד פּראָטעינס (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 און SNW1) און טראַנספעקטעד פּלאַסמיידז צו ויסשטעלן די גענעס צו נאָרמאַל HEK293T און סטאַביל עקספּרעסס מיניSOG-Parkin ס HEK293T באַהאַנדלונג.די לעוועלס פון Ssu72 און SNW1 פּראָטעינס זענען באטייטיק רידוסט אין די סטאַביל מיניSOG-Parkin שורה (Fig. 5e).באַהאַנדלונג מיט CCCP פֿאַר 12 שעה ריזאַלטיד אין די מערסט באַטייַטיק דערנידעריקונג פון ביידע סאַבסטרייץ.צו פאָרשן צי די דערנידעריקונג פון Ssu72 און SNW1 איז רעגיאַלייטאַד דורך פּראָטעאַסאָמע-וביקוויטינאַטיאָן, די פּראָטעאַסאָמע ינכיבאַטער MG132 איז צוגעגעבן צו ינכיבאַט פּראָטעאַסאָמע טעטיקייט, און אין פאַקט מיר געפֿונען אַז זייער דערנידעריקונג פּראָצעס איז ינכיבאַטיד (Fig. 5f).נאָך ניט-סאַבסטרייט טאַרגאַץ זענען באשטעטיקט ווי פּאַרקין ינטעראַקטערז ניצן מערב בלאָטינג (סופּפּלעמענטאַרי פייג. קסנומקס), וואָס געוויזן קאָנסיסטענט רעזולטאַטן מיט לק-מס / מיז.אין מסקנא, די ינאַגריישאַן פון די PDPL וואָרקפלאָוו מיט וועראַפאַקיישאַן פון ציל פּראָטעין טראַנספעקשאַן אַלאַוז די לעגיטימאַציע פון ​​אַנרעדזשיסטערד E3 ליגאַסע סאַבסטרייץ.
מיר האָבן דעוועלאָפּעד אַ פּראָסט פּראַקסימאַטי מאַרקינג פּלאַטפאָרמע וואָס אַלאַוז איר צו ידענטיפיצירן פּאָי ינטעראַקטינג אין פּלאַץ און צייט.די פּלאַטפאָרמע איז באזירט אויף די מיניסאָג פאָטאָסענסיטיזער פּראָטעין, וואָס איז בלויז וועגן 12 kDa, ווייניקער ווי האַלב די גרייס פון די דערוואַקסן APEX2 ענזיים (27 kDa) און 1/3 די גרייס פון TurboID (35 kDa).דער קלענערער גרייס זאָל זייער יקספּאַנד די קייט פון אַפּלאַקיישאַנז פֿאַר לערנען קליין פּראָטעין ינטעראַקטאָומז.ווייַטער עקספּלעריישאַן פון נאָך פאָטאָסענסיטיזערז, צי דזשאַנעטיקלי ענקאָודיד פּראָטעינס אָדער קליין מאַלאַקיולז, איז דארף צו פאַרגרעסערן די קוואַנטום טראָגן פון סינגלעט זויערשטאָף און יקספּאַנד די סענסיטיוויטי פון דעם צוגאַנג.פֿאַר די קראַנט ווערסיע פון ​​מיניסאָג, הויך טעמפּעראַל האַכלאָטע קענען זיין אַטשיווד מיט בלוי ילומאַניישאַן צו אַקטאַווייט פּראַקסימאַטי מאַרקערס.אין אַדישאַן, מער ויסשטעלן צייט באפרייט אַ גרעסערע "וואָלקן" פון סינגלעט זויערשטאָף, ריזאַלטינג אין מאָדיפיקאַטיאָן פון מער דיסטאַל היסטידינע רעזאַדוז, געוואקסן לייבלינג ראַדיוס און די פיייקייט צו פיין-טון די ספּיישאַל האַכלאָטע פון ​​PDPL.מיר אויך טעסטעד זיבן כעמישער פּראָבעס צו פאַרגרעסערן די סיגנאַל-צו-הינטערגרונט פאַרהעלטעניש און יקספּלאָרד די מאָלעקולאַר מעקאַניזאַם הינטער דעם צוגאַנג.די TOP-ABPP וואָרקפלאָוו קאַמביינד מיט אַנבייאַסט עפענען זוכן באשטעטיקט אַז מאָדיפיקאַטיאָנס זענען פארגעקומען בלויז אין היסטידינעס און קיין קאָנסיסטענט מיקראָענוויראָנמענט איז באמערקט פֿאַר געוואקסן היסטידינע מאָדיפיקאַטיאָנס, אַחוץ פֿאַר אַ מעסיק ייבערהאַנט פֿאַר כיסטידינעס אין די שלייף געגנט.
PDPL איז אויך געניצט צו קעראַקטערייז סובסעללולאַר פּראָטעאָמעס מיט פּראָטעאָמע ספּעסיפיקאַטי און קאַווערידזש אין מינדסטער פאַרגלייַכלעך מיט אנדערע פּראַקסימאַטי לייבלינג און אָרגאַנעל-ספּעציפיש כעמישער זאָנד מעטהאָדס.פּראַקסימאַטי מאַרקערס זענען אויך הצלחה געניצט צו קעראַקטערייז די ייבערפלאַך, ליסאָסאָמאַל און סעקרעטאָמע-פארבונדן פּראָטעאָמעס46,47.מיר גלויבן אַז PDPL וועט זיין קאַמפּאַטאַבאַל מיט די סובסעללולאַר אָרגאַנאַלז.אין אַדישאַן, מיר טשאַלאַדזשד PDPL דורך ידענטיפיצירן טאַרגאַץ פֿאַר סיטאָסאָליק פּראָטעין ביינדינג וואָס זענען מער קאָמפּליצירט ווי מעמבראַנע געבונדן פּראָטעינס רעכט צו זייער דינאַמיש פּראָפּערטיעס און ינוואַלוומאַנט אין מער טעמפּעראַל ינטעראַקשאַנז.PDPL איז געווען געווענדט צו צוויי פּראָטעינס, די טראַנסקריפּטיאָנאַל קאָאַקטיוואַטאָר ברד4 און די קרענק-פארבונדן ליגאַסע E3 פּאַרקין.די צוויי פּראָטעינס זענען אויסדערוויילט ניט בלויז פֿאַר זייער פונדאַמענטאַל בייאַלאַדזשיקאַל פאַנגקשאַנז, אָבער אויך פֿאַר זייער קליניש שייכות און טעראַפּיוטיק פּאָטענציעל.פֿאַר די צוויי פּאָי, געזונט-באקאנט ביינדינג פּאַרטנערס און אַנרעדזשיסטערד טאַרגאַץ זענען יידענאַפייד.נאָוטאַבלי, די פאַסע צעשיידונג-פארבונדן פּראָטעין SFPQ איז באשטעטיקט דורך קאָ-IP, וואָס קען אָנווייַזן אַ נייַע מעקאַניזאַם דורך וואָס BRD4 (קורץ יסאָפאָרם) רעגיאַלייץ LLPS.אין דער זעלביקער צייט, מיר גלויבן אַז די לעגיטימאַציע פון ​​פּאַרקין סאַבסטרייץ איז אַ סצענאַר אין וואָס די לעגיטימאַציע פון ​​ומדירעקט אַדכיסיווז איז פארלאנגט.מיר יידענאַפייד צוויי אַניידענטאַפייד פּאַרקין סאַבסטרייץ און באשטעטיקט זייער דערנידעריקונג צוזאמען די וביקוויטינאַטיאָן-פּראָטעאַסאָמע פּאַטוויי.לעצטנס, אַ מעקאַניזאַם-באזירט טראַפּינג סטראַטעגיע איז דעוועלאָפּעד צו דעטעקט הידראָלאַסע סאַבסטרייץ דורך טראַפּינג זיי מיט ענזימעס.כאָטש דאָס איז אַ זייער שטאַרק אופֿן, עס איז נישט פּאַסיק פֿאַר אַנאַליסיס פון סאַבסטרייץ ינוואַלווד אין די פאָרמירונג פון גרויס קאַמפּלעקסאַז און ריקווייערז די פאָרמירונג פון קאָוואַלענט קייטן צווישן די ענזיים און די סאַבסטרייט.מיר דערוואַרטן אַז PDPL קענען זיין עקסטענדעד צו לערנען אנדערע פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און ענזיים פאַמיליעס, אַזאַ ווי דעוביקוויטינאַסע און מעטאַללאָפּראָטעאַסע פאַמיליעס.
א נייַע פאָרעם פון מיניסאָג, גערופן SOPP3, איז דעוועלאָפּעד מיט ימפּרוווד סינגלעט זויערשטאָף פּראָדוקציע.מיר קאַמפּערד מיניסאָג מיט SOPP3 און געפֿונען ימפּרוווד מאַרקינג פאָרשטעלונג, כאָטש די סיגנאַל-צו-ראַש פאַרהעלטעניש איז פארבליבן אַנטשיינדזשד (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 11).מיר כייפּאַטאַסייזד אַז אַפּטאַמאַזיישאַן פון SOPP3 (למשל, דורך דירעקטעד עוואָלוציע) וואָלט פירן צו מער עפעקטיוו פאָטאָסענסיטיזער פּראָטעינס וואָס דאַרפן קירצער ליכט צייט און אַזוי לאָזן מער דינאַמיש סעליאַלער פּראַסעסאַז צו זיין קאַפּטשערד.נאָוטאַבלי, די קראַנט ווערסיע פון ​​PDPL איז לימיטעד צו די סעליאַלער סוויווע ווייַל עס ריקווייערז בלוי ליכט ילומאַניישאַן און קענען נישט דורכנעמען טיף געוועבן.דעם שטריך פּריקלודז זייַן נוצן אין כייַע מאָדעל שטודיום.אָבער, די קאָמבינאַציע פון ​​​​אָפּטאָגענעטיקס מיט PDPL קען צושטעלן אַ געלעגנהייט פֿאַר כייַע פאָרשונג, ספּעציעל אין דעם מאַרך.אין אַדישאַן, אנדערע ענדזשאַנירד ינפרערעד פאָטאָסענסיטיזערז אויך באַזייַטיקן דעם באַגרענעצונג.פאָרשונג איז איצט אַנדערוויי אין דעם געגנט.
די HEK293T צעל ליניע איז באקומען פון ATCC (CRL-3216).די צעל ליניע טעסטעד נעגאַטיוו פֿאַר מיקאָפּלאַסמאַ ינפעקציע און איז געווען קאַלטשערד אין DMEM (Thermo, #C11995500BT) סאַפּלאַמענטאַד מיט 10% פיטאַל באָווין סערום (FBS, Vistech, #SE100-B) און 1% פּעניסיללין / סטרעפּטאָמיסין (Hyclone, #SV30010).געוואקסן אין.
3-אַמינאָפענילענע (מוסטער 3) און (4-עטינילפעניל) מעטאַנאַמינע (מוסטער 4) זענען געקויפט פון Bidepharm.פּראָפילאַמינע (זאָנד 2) איז געקויפט פון ענערגיע-קעמיקאַלז.N-(2-אַמינאָפעניל) פּענט-4-ינאַמידע (זאָנד 1) איז סינטאַסייזד לויט ארויס מעטהאָדס.
סאַפּלאַמענערי טאַבלע 1 ליסטעד די גענעטיק קאַנסטראַקשאַנז געניצט אין דעם לערנען.די מיניסאָג און קיללעררעד סיקוואַנסיז זענען קלאָונד פֿון אַ טאַלאַנט פּלאַזמיד פון P. Zou (Peking University).די מיטאָטשאָנדריאַל מאַטריץ טאַרגאַטינג סיקוואַנס איז דערייווד פון די 23 N-וואָקזאַל אַמינאָ אַסאַדז פון COX4 און קלאָונד אין די אנגעוויזן וועקטאָרס ניצן אַ גיבסאָן פֿאַרזאַמלונג (Beyotime, #D7010S).צו ציל די מעמבראַנע און קערן פון די ענדאָפּלאַסמיק רעטיקולום, SEC61B מענטש דנאַ (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) אַמפּלאַפייד דורך פּקר פון אַ cDNA ביבליאָטעק פון HEK293T סעלז, און H2B DNA (דאָנייטיד דורך D. Lin, שענזשען בייַ לאַבאָראַטאָריע) וּמִקְלוֹנִים, כְּמוֹ לְעֵילָּא.סיידן אַנדערש אנגעוויזן, אנדערע פּראָטעין גענעס געניצט פֿאַר טראַנספעקשאַן און קאַנסטראַקשאַן פון סטאַביל צעל שורות זענען פּקר אַמפּלאַפייד פון די HEK293T צעל קדנאַ ביבליאָטעק.G3S (GGGS) און G4S (GGGGS) זענען געניצט ווי לינקס צווישן די לעקעכל פּראָטעין און מיניסאָג.א V5 עפּיטאָפּע קוויטל (GKPIPNPLLGLDST) איז צוגעגעבן צו די פוסיאָן קאַנסטראַקשאַנז.פֿאַר אויסדרוק אין מאַמאַלז און צו פאַרלייגן אַ סטאַביל צעל ליניע, די מיניסאָג פוסיאָן קאַנסטראַקט איז געווען סאַבקלאָנד אין די פּLX304 לענטיוויראַל וועקטאָר.פֿאַר באַקטיריאַל אויסדרוק, מיניסאָג איז קלאָונד אין די pET21a וועקטאָר מיטן נאָמען 6xHis אין די C-טערמינוס.
HEK293T סעלז זענען סידעד אין 2.0 רענטגענ 105 סעלז פּער געזונט אין זעקס-געזונט פּלאַטעס און טראַנספעקטעד 24 שעה שפּעטער מיט רעקאָמבינאַנט לענטיוויראַל פּלאַסמיידז (2.4 μg plX304) און וויראַל פּאַקקאַגינג פּלאַסמיידז (1.5 μg psPAX2 און 1.2μg PSPAX2 און 1.2μg μgbeyo. , #C0533), וועגן 80% פוסיאָן.נאָך יבערנאַכטיק טראַנספעקשאַן, די מיטל איז געביטן און ינקובייטיד פֿאַר נאָך 24 שעה.די זאַמלונג פון די ווירוס איז דורכגעקאָכט נאָך 24, 48 און 72 שעה.איידער די ינפעקציע פון ​​די ציל צעל שורות, די וויראַל מיטל איז געווען פילטערד דורך אַ 0.8 μם פילטער (Merck, #millex-GP) און פּאָליברענע (Solarbio, #H8761) איז צוגעגעבן צו אַ קאַנסאַנטריישאַן פון 8 μג / מל.נאָך 24 שעה, די סעלז זענען ערלויבט צו צוריקקריגן דורך טשאַנגינג די מיטל.סעלז זענען אויסגעקליבן מיט 5 μג / מל בלאַסטיסידין (Solarbio, #3513-03-9) פֿאַר די ערשטער דריי פּאַסידזשיז ווי אַ נידעריקער סטרינדזשאַנט סעלעקציע.דערנאָך געוויינט 20 μג / מל ווי אַ מער סטרינדזשאַנט רעזשים פֿאַר די ווייַטער דריי פּאַסידזשיז.
סעלז זענען סידעד אין 12-געזונט טשיימבערז (יבידי, #81201) אין אַ געדיכטקייַט פון בעערעך 20,000 סעלז פּער געזונט.צו פֿאַרבעסערן אַדכיזשאַן פון HEK293T סעלז, לייגן 50 μג / מל פיבראָנעקטין (קאָרנינג, #356008) דיילוטאַד אין פאַספייט באַפערד סאַלין (PBS, Sangon, #B640435) ביי 37 °C.די טשיימבערז זענען פּרעטרעאַטעד פֿאַר 1 שעה און דעמאָלט אַוועקגענומען מיט פּבס.נאָך 24 שעה, סעלז זענען געוואשן אַמאָל מיט פּבס, ינקובייטיד מיט 1 מם זאָנד 3 אין פריש האַנקס באַלאַנסט זאַלץ לייזונג (HBSS, Gibco, #14025092) פֿאַר 1 שעה ביי 37 ° C, און דעמאָלט ינקובייטיד מיט אַ בלוי געפירט (460 nm) ).) זענען יריידיייטיד פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.נאָך דעם, די סעלז זענען געוואשן צוויי מאָל מיט פּבס און פאַרפעסטיקט מיט 4% פאָרמאַלדאַכייד אין פּבס (סאַנגאָן, # ע672002) פֿאַר 15 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.וידעפדיק פאָרמאַלדאַכייד איז אַוועקגענומען פון פאַרפעסטיקט סעלז דורך וואַשינג דריי מאָל מיט פּבס.סעלז זענען דעמאָלט פּערמיאַבאַלייזד מיט 0.5% טריטאָן X-100 (סאַנגאָן, # אַ600198) אין פּבס און געוואשן 3 מאל מיט פּבס.דערנאָך אַראָפּנעמען די קאַמער און לייגן צו יעדער מוסטער 25 μל פון אַ קליק אָפּרוף געמיש מיט 50 μM Cy3-אַזידע (Aladdin, #C196720), 2 MM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 MM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) און 0.5 מג / מל סאָדיום אַסקאָרבאַטע (אַלאַדדין, ניט ס105024) און ינקובייטיד פֿאַר 30 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.נאָך אַ קנאַקן אָפּרוף, סעלז זענען געוואשן זעקס מאָל מיט פּבס מיט 0.05% טוועען-20 (סאַנגאָן, # אַ600560) (פּבסט) און דעמאָלט אפגעשטעלט מיט 5% בסאַ (אַבקאָנע, # ב24726) אין פּבסט פֿאַר 30 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.
פֿאַר קאָלאָקאַליזאַטיאָן ימיונאַסטיינינג, סעלז זענען ינקובייטיד מיט ערשטיק אַנטיבאָדיעס לויט די אנגעוויזן טנאָים: מויז אַנטי-V5 טאַג מאַב (1:500, CST, #80076), קיניגל אַנטי-הספּ60 מאַב (1:1000), אַקלאָנאַל, #אַ0564), קיניגל פּאָליקלאָנאַל אַנטי-קאַלנעקסין אַנטיבאָדי (1:500, אַבקאַם, #אַב22595) אָדער קיניגל אַנטי-לאַמין אַ / C מאַנאַקלאָנאַל אַנטיבאָדי (1:500; קסט, #2032) ביי 4 °C יבערנאַכטיק.נאָך וואַשינג 3 מאל מיט פּבסט, סעלז זענען ינגקיובייטיד מיט צווייטיק אַנטיבאָדיעס: ציגעלע אַנטי-קיניגל Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) דיילוטאַד 1:1000, ציגעלע אַנטי-מויז Alexa Fluor 594 (CST, #8889) דיילוטאַד 1:1000.דיילושאַן צעפירן אין צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט.סעלז זענען דעמאָלט געוואשן 3 מאל מיט פּבסט און קאַונטערסטיינד מיט דאַפּי (טהערמאָ, # ד1306) אין פּבס פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.נאָך 3 וואַשיז מיט פּבס, סעלז זענען געחתמעט אין 50% גליסעראָל (סאַנגאָן, # אַ600232) אין פּבס פֿאַר ימידזשינג.יממונאָפלורעסאַנט בילדער זענען באקומען מיט אַ ZEISS LSM 900 Airyscan2 קאַנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ און ZNE 3.5 ווייכווארג.
פֿאַר סינגלעט זויערשטאָף פלורעסאַנט ימאַגינג, סעלז זענען געוואשן צוויי מאָל מיט Hanks HEPES באַפער איידער אַדינג 100 nM Si-DMA אין Hanks HEPES באַפער (DOJINDO, #MT05).נאָך ויסשטעלן צו ליכט, די סעלז זענען ינגקיובייטיד אין אַ CO2 ינגקיאַבייטער בייַ 37 ° C פֿאַר 45 מינוט.סעלז זענען דעמאָלט געוואשן צוויי מאָל מיט Hanks 'HEPES באַפער און קאַונטערסטיינד מיט Hoechst אין Hanks' HEPES באַפער פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור און וויזשוואַלייזד מיט אַ ZEISS LSM 900 קאַנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ., #M36008) אין HBSS באַפער מיט קאַלסיום און מאַגניזיאַם.נאָך ויסשטעלן צו ליכט אָדער דאָקסאָרוביסין (MCE, #HY-15142A), סעלז זענען ינגקיובייטיד אין אַ CO2 ינגקיאַבייטער בייַ 37 ° סי פֿאַר 10 מינוט, געוואשן צוויי מאָל מיט HBSS באַפער, און ינגקיובייטיד מיט Hoechst אין HBSS באַפער אין צימער טעמפּעראַטור.מינוט.דאָקסאָרוביסין איז געניצט ווי אַ positive זאָנד קאָנטראָל ווו סעלז זענען באהאנדלט מיט 20 μM דאָקסאָרוביסין אין HBSS מיט 1% BSA פֿאַר 30 מינוט.יממונאָפלורעסאַנט בילדער זענען באקומען מיט אַ Zeiss LSM 900 קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּ.
HEK293T סעלז וואָס סטאַביל יקספּרעסינג מיטאָ-מיניסאָג זענען סידעד אין אַ געדיכטקייַט פון בעערעך 30% אין 15 סענטימעטער קיילים.נאָך 48 שעה, ווען ~ 80% קאַנפלואַנס איז ריטשט, די סעלז זענען געוואשן אַמאָל מיט פּבס, ינקובייטיד מיט 1 מם פּראָבע 3 אין פריש HBSS באַפער פֿאַר 1 שעה ביי 37 ° C און דעמאָלט ילומאַנייטאַד מיט אַ בלוי געפירט פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור..דערנאָך, די סעלז זענען געוואשן צוויי מאָל מיט פּבס, סקרייפּט און ריסאַספּאַנדיד אין ייַז-קאַלט פּבס באַפער מיט עדטאַ-פֿרייַ פּראָטעאַסע ינכיבאַטערז (MCE, #HY-K0011).סעלז זענען ליסעד דורך סאָניקאַטינג די שפּיץ פֿאַר 1 מינוט (1 רגע אויף און 1 רגע אַוועק ביי 35% אַמפּליטוד).די ריזאַלטינג געמיש איז געווען סענטריפוגדעד ביי 15,871 קסג פֿאַר 10 מינוט ביי 4 ° C צו באַזייַטיקן דעבריס, און די סופּערנאַטאַנט קאַנסאַנטריישאַן איז אַדזשאַסטיד צו 4 מג / מל ניצן אַ BCA פּראָטעין אַסיינמאַנט קיט (Beyotime, # P0009).קאַמביין 1 מל פון די אויבן ליסאַטע מיט 0.1 מם פאָטאָדעגראַדאַבלע ביאָטין אַזידע (קאָנפלואָרע, #BBBD-14), 1 מם TCEP (סאַנגאָן, # אַ600974), 0.1 מם טבטאַ ליגאַנד (אַלאַדדין, # ט162437), און 1 מם CuSO4 ינגקיאַבייטער ראָוטיישאַן אַרויף פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור.נאָך אַ קנאַקן אָפּרוף, לייגן די געמיש צו די פאַר-געמישט לייזונג (MeOH: CHCl3: H2O = 4 מל: 1 מל: 3 מל) אין אַ 10 מל גלאז וויאַל.די סאַמפּאַלז זענען געמישט און סענטריפוגעד בייַ 4500 ג פֿאַר 10 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.דער נידעריקער און אויבערשטער סאַלושאַנז זענען אַוועקגענומען, די אָפּזאַץ איז געוואשן צוויי מאָל מיט 1 מל פון מעטאַנאָל און סענטריפוגעד ביי 15871 × ג פֿאַר 5 מינוט בייַ 4 ° C.לייג 1 מל פון 8 ם ורעאַ (אַלאַדדין, נומ ו111902) אין 25 מם אַמאָוניאַם בייקאַרבאָנאַטע (אַבק, אַלאַדדין, נומ אַ110539) צו צעלאָזן די אָפּזאַץ.סאַמפּאַלז זענען ריקאַנסטאַטוטאַד מיט 10 מם דיטהיאָטהרעיטאָל (סאַנגאָן, # A100281 אין 25 מם אַבק) פֿאַר 40 מינוט ביי 55 ° C נאכגעגאנגען דורך די אַדישאַן פון 15 מם פריש יאָדאָאַסעטאַמידע (סאַנגאָן, # A600539) אין צימער טעמפּעראַטור אין דער פינצטער.אַלקיאַליישאַן ין 30 מינוט..אַן נאָך 5 מם דיטהיאָטהרעיטאָל איז צוגעגעבן צו האַלטן די אָפּרוף.צוגרייטן בעערעך 100 μל נעוטראַווידין אַגאַראָסע קרעלן (טהערמאָ, #29202) פֿאַר יעדער מוסטער דורך וואַשינג 3 מאל מיט 1 מל פּבס.די אויבן פּראָטעאָמע לייזונג איז דיילוטאַד מיט 5 מל פּבס און ינקובייטיד מיט פאַר-געוואשן נעוטראַווידין אַגאַראָסע קרעלן פֿאַר 4 שעה אין צימער טעמפּעראַטור.די קרעלן זענען דעמאָלט געוואשן 3 מאל מיט 5 מל PBS מיט 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 מאל מיט 5 מל PBS מיט 1M ורעאַ, און 3 מאל מיט 5 מל דדH2O.די קרעלן זענען דעמאָלט כאַרוואַסטיד דורך סענטריפוגיישאַן און ריסאַספּאַנדיד אין 200 μל פון 25 מם אַבק מיט 1 ם ורעאַ, 1 מם קאַקל 2 (מאַקלין, # ק805228) און 20 נג / μל טריפּסין (פּראָמעגאַ, # וו5280).טריפּסיניזע יבערנאַכטיק בייַ 37 ° C מיט ראָוטיישאַן.דער אָפּרוף איז סטאַפּט דורך אַדינג פאָרמיק זויער (טהערמאָ, # A117-50) ביז די ף ריטשט 2-3.די קרעלן זענען געוואשן 3 מאל מיט 1 מל פון פּבס מיט 0.2% סדס, 3 מאל מיט 1 מל פון פּבס מיט 1 ם ורעאַ, און דעמאָלט 3 מאל מיט 1 מל פון דיסטילד וואַסער.די מאַדאַפייד פּעפּטיידז זענען באפרייט דורך ליכט ליסיס (365 נם) פֿאַר 90 מינוט ניצן 200 μל פון 70% מעאָה.נאָך סענטריפוגיישאַן, די סופּערנאַטאַנט איז געזאמלט.די קרעלן זענען דעמאָלט געוואשן אַמאָל מיט 100 μל פון 70% מעאָה און די סופּערנאַטאַנץ זענען פּאָאָלד.סאַמפּאַלז זענען דאַר אין אַ ספּעעדוואַק וואַקוום קאָנסענטראַטאָר און סטאָרד בייַ -20 ° C ביז אַנאַליסיס.
צו ידענטיפיצירן און קוואַנטיפיצירן סינגלעט זויערשטאָף פּעפּטיידז, סאַמפּאַלז זענען רידיסאַלווד אין 0.1% פאָרמיק זויער און 1 μג פּעפּטיידז זענען אַנאַלייזד מיט אַן אָרביטראַפּ Fusion Lumos Tribrid מאַסע ספּעקטראָמעטער יקוויפּט מיט אַ נאַנאָ ESI מקור פֿון Tune און Xcalibur פֿון פאַרקויפער ווייכווארג 4.3.סאַמפּאַלז זענען אפגעשיידט אויף אַ 75 μm × 15 סענטימעטער ינעווייניק פּאַקט קאַפּאַלערי זייַל מיט 3 μm C18 מאַטעריאַל (ReproSil-pur, #r13.b9.) און קאָננעקטעד צו אַן EASY-nlC 1200 UHPLC סיסטעם (טערמאָ).די פּעפּטיידז זענען אפגעשיידט דורך לינעאַר 95 מינוט גראַדיענט קראָומאַטאַגראַפי פון 8% סאַלוואַנט ב צו 50% סאַלוואַנט ב (א = 0.1% פאָרמיק זויער אין וואַסער, ב = 0.1% פאָרמיק זויער אין 80% אַסעטאָניטרילע), דעמאָלט לינעאַרלי געוואקסן צו 98% ב מין. אין 6 מינוט מיט אַ לויפן קורס פון 300 נל / מין.Orbitrap Fusion Lumos קאַלעקץ דאַטן אָלטערנאַטלי צווישן פול MS יבערקוקן און MS2 יבערקוקן דיפּענדינג אויף די דאַטן.די ספּאַטערינג וואָולטידזש איז געווען באַשטימט צו 2.1 קוו און די טעמפּעראַטור פון די יאָן אַריבערפירן קאַפּאַלערי איז געווען 320 °C.MS ספּעקטראַ (350-2000 עם / ז) זענען געזאמלט מיט אַ האַכלאָטע פון ​​120,000, AGC 4 × 105, און אַ מאַקסימום אַרייַנשרייַב צייט פון 150 מיז.די 10 מערסט פּראָסט פּריקערסערז אין יעדער פול יבערקוקן זענען פראַגמאַנטיד מיט HCD מיט אַ נאָרמאַלייזד צונויפשטויס ענערגיע פון ​​​​30%, אַ קוואַדרופּאָלע אפגעזונדערטקייט פֿענצטער פון 1.6 עם / ז און אַ האַכלאָטע באַשטעטיקן פון 30,000.אַן AGC ציל פֿאַר טאַנדאַם מאַסע ספּעקטראָמעטרי ניצן 5 × 104 און מאַקסימום אַרייַנשרייַב צייט 150 מיז.די דינאַמיש ויסנעם איז באַשטימט צו 30 סעקונדעס. ונסאַסיינד ייאַנז אָדער יענע מיט אַ אָפּצאָל פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS. ונסאַסיינד ייאַנז אָדער יענע מיט אַ אָפּצאָל פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ און >7+ отклонены для МС/МС. ונסאַסיינד ייאַנז אָדער ייאַנז מיט אַ אָפּצאָל פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ און >7+ отклонены для МС/МС. ונספּעסיפיעד ייאַנז אָדער ייאַנז מיט טשאַרדזשיז פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS.
די רוי דאַטן זענען פּראַסעסט מיט די FragPipe קאַמפּיוטינג פּלאַטפאָרמע באזירט אויף MSFragger.מאַסע בייאַסיז און קאָראַספּאַנדינג אַמינאָ אַסאַדז זענען באשלאסן מיט אַ עפענען זוכן אַלגערידאַם מיט אַ פּריקערסער מאַסע טאָלעראַנץ פון -150 צו 500 דאַ.מאָדיפיעד פּעפּטיידז זענען דעמאָלט יידענאַפייד מיט היסטידינע מאָדיפיקאַטיאָנס מיט מאַסע גיינז פון +229.0964 און +247.1069 דאַ אין פּד (פּראָטעאָמע דיסקאָווערער 2.5, טערמאָ).
סעלז וואָס האָבן סטאַביל יקספּרעסינג די פיוזד מיניסאָג דזשין זענען פּלייטאַד אין 6 סענטימעטער קיילים.ווען זיי דערגרייכן ~ 80% קאַנפלואַנס, סעלז זענען געוואשן אַמאָל מיט HBSS (Gibco, #14025092), דעמאָלט ינקובייטיד מיט כעמיש פּראָבעס אין HBSS פֿאַר 1 שעה בייַ 37 ° C און ילומאַנייטאַד מיט בלוי ליכט.10 וו געפֿירט פֿאַר 20 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.צו באַשליסן וואָס טיפּ פון ריאַקטיוו זויערשטאָף מינים איז ינוואַלווד אין PDPL, 0.5 מם וויטאַמין C (MCE, #HY-B0166), 5 מם טראָלאָקס (MCE, #HY-101445), D2O (סיגמאַ, #7789-20-0), 100 מם מאַנניטאָל (ענערגיע כעמישער, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 מם NaN3 זענען מוסיף צו די סעלז ווי ביילאגעס.נאָך וואַשינג מיט קאַלט פּבס, סעלז זענען סקרייפּט, געזאמלט אין 1.5 מל סענטריפודזש טובז און סאָניקאַטעד מיט אַ שפּיץ פֿאַר 1 מינוט אין 200 μל פון פּבס מיט 1 קס פּראָטעאַסע ינכיבאַטער אָן עדטאַ (1 s און 1 s אָן, אַמפּליטוד 35%).די ריזאַלטינג געמיש איז געווען סענטריפוגדעד ביי 15,871 × ג פֿאַר 10 מינוט ביי 4 ° C און די סופּערנאַטאַנט קאַנסאַנטריישאַן איז אַדזשאַסטיד צו 1 מג / מל ניצן אַ בקאַ פּראָטעין אַסאַסי ינווענטאַר.בעערעך 50 μל פון די אויבן ליסאַטע איז ינקובייטיד מיט 0.1 מם רהאָדאַמינע אַזידע (אַלאַדדין, נומ ט131368), 1 מם TCEP, 0.1 מם טבטאַ ליגאַנד, און 1 מם קוסאָ4 פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור מיט ראָוטיישאַן פון דנאָ צו שפּיץ.נאָך דעם גיט אָפּרוף, אָפּזאַץ מיט אַסאַטאָון איז דורכגעקאָכט דורך אַדינג 250 μל פון פאַר-קילד אַסאַטאָון צו די סאַמפּאַלז, ינגקיובייטינג ביי -20 ° C פֿאַר 20 מינוט און סענטריפוגינג ביי 6010 × ג פֿאַר 10 מינוט ביי 4 ° C.קלייַבן די שרייטל און קאָכן אין 50 μל פון 1 קס לאַעממלי ס באַפער פֿאַר 10 מינוט בייַ 95 °C.סאַמפּאַלז זענען דערנאָך אַנאַלייזד אויף SDS-PAGE לאַנג דזשעלז און וויזשוואַלייזד מיט די Bio-rad ChemiDoc MP Touch ימאַגינג סיסטעם מיט Image Lab Touch ווייכווארג.
אויסדרוק און רייניקונג פון די רעקאָמבינאַנט miniSOG-6xHis פּראָטעין איז דורכגעקאָכט ווי פריער דיסקרייבד.בעקיצער, E. coli BL21 (DE3) סעלז (טראַנסגען, #CD701-02) זענען פארוואנדלען מיט pET21a-miniSOG-6xHis און פּראָטעין אויסדרוק איז ינדוסט מיט 0.5 מם IPTG (Sangon, #A600168).נאָך צעל ליסיס, פּראָטעינס זענען פּיוראַפייד ניצן Ni-NTA אַגאַראָסע קרעלן (MCE, נומ. 70666), דייאַליסיזעד קעגן פּבס, און סטאָרד בייַ -80 ° C.
פֿאַר אַן אַנטיבאָדי-באזירט אין וויטראָ פירמע פּראַקסימאַטי אַסייַ, מישן 100 μM פּיוראַפייד מיניסאָג, 1 מם זאָנד 3 און 1 μג אַנטי-פירמע מויז מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (טראַנסגען, #HT501-01) אין PBS צו אַ גאַנץ אָפּרוף באַנד פון 50 μל..דער אָפּרוף געמיש איז געווען יריידיייטיד מיט בלוי געפירט ליכט פֿאַר 0, 2, 5, 10 און 20 מינוט אין צימער טעמפּעראַטור.דער געמיש איז ינקובייטיד מיט 0.1 מם ביאָטין-PEG3-אַזידע (אַלאַדדין, #B122225), 1 מם TCEP, 0.1 מם טבטאַ ליגאַנד און 1 מם קוסאָ4 פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור אויף אַ אַרוף באַוועגונג שייקער.נאָך אַ קנאַקן אָפּרוף, לייגן 4x Laemmli ס באַפער גלייַך צו די געמיש און קאָכן בייַ 95 ° C פֿאַר 10 מינוט.סאַמפּאַלז זענען אַנאַלייזד אויף SDS-PAGE דזשעלז און אַנאַלייזד דורך מערב בלאָטינג מיט סטרעפּטאַווידין-HRP (1:1000, סאָלאַרביאָ, #SE068).
א כיסטידינע-מיט סינטעטיש פּעפּטייד מיט C-וואָקזאַל אַמידיישאַן (LHDALDAK-CONH2) איז געניצט צו אַנאַלייז נירביי פּעפּטייד-באזירט אין וויטראָ לייבלינג.אין דעם אַסייַ, 100 μM פּיוראַפייד מיניסאָג, 10 מם זאָנד 3 און 2 μg / מל סינטעטיש פּעפּטייד זענען געמישט אין פּבס אין אַ גאַנץ אָפּרוף באַנד פון 50 μל.דער אָפּרוף געמיש איז געווען יריידיייטיד מיט בלוי געפירט ליכט פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור.איין מיקראָליטער פון מוסטער איז אַנאַלייזד מיט אַ LC-MS סיסטעם (וואַטערס, SYNAPT XS Ions מאָביליטי צייט-פון-פלי מאַסע ספּעקטראָמעטער מיט MassLynx ספּעקטרום אַנאַליסיס ווייכווארג).
HEK293T סעלז וואָס סטאַביל יקספּרעסינג די מיניסאָג פוסיאָן דזשין זענען סידעד אין 10 סענטימעטער קיילים פֿאַר שורות מיט פאַרשידענע אָרגאַנעל לאָוקאַלאַזיישאַן (מיטאָ, ער, נוקלעוס) און 15 סענטימעטער קיילים פֿאַר Parkin-miniSOG און BRD4-miniSOG שורות.ווען ריטשינג ~ 90% קאַנפלואַנס, די סעלז זענען געוואשן אַמאָל מיט HBSS, דעמאָלט ינקובייטיד מיט זאָנד 3 אין HBSS פֿאַר 1 שעה בייַ 37 ° C און ילומאַנייטאַד מיט אַ 10 וו בלוי געפירט אין צימער טעמפּעראַטור.פֿאַר ניט-קאָנטאַקט לייבלינג פון פּאַרקין, 10 μM פּראָטאָן קאַרבאָניל סייאַנייד טרעגער עם-טשלאָראָפענילהידראַזאָנע CCCP (Solarbio, #C6700) מיט זאָנד 3 אין HBSS איז צוגעגעבן פֿאַר 1 שעה ביי 37 ° C.די צעל ליסיס, קליק כעמיע, רעדוקציע און אַלקילאַטיאָן סטעפּס זענען די זעלבע ווי דיסקרייבד אויבן, אַחוץ אַז 2 מג ליסאַטע איז צוגעגעבן און ביאָטין PEG3 אַזידע איז געניצט אין די קליק אָפּרוף אַנשטאָט פון פאָטאָדעגראַדאַבלע ביאָטין אַזידע.נאָך ענריטשמענט, די קרעלן זענען געוואשן 3 מאל מיט 5 מל פון PBS מיט 0.2% SDS, 3 מאל מיט 5 מל פון PBS מיט 1 M ורעאַ, און 3 מאל מיט 5 מל פון PBS.דערנאָך, 2 μג טריפּסין איז מוסיף צו 300 μל 25 מם אַבק מיט 1 M ורעאַ צו שפּאַלטן די פּראָטעין יבערנאַכטיק ביי 37 ° C.דער אָפּרוף איז סטאַפּט דורך אַדינג פאָרמיק זויער ביז אַ ף פון 2-3 איז ריטשט.נאָך טריפּסיניזאַטיאָן אויף קרעלן, די פּעפּטייד לייזונג איז דעסאַלטעד מיט אַ SOLAµ HRP זייַל (טהערמאָ, #60209-001) און דאַר אין אַ ספּעעדוואַק וואַקוום קאָנסענטראַטאָר.פּעפּטיידז זענען רידיסאַלווד אין 0.1% פאָרמיק זויער און 500 נג פּעפּטיידז זענען אַנאַלייזד מיט אַן אָרביטראַפּ פוסיאָן לומאָס טריבריד מאַסע ספּעקטראָמעטער יקוויפּט מיט די נאַנאָ-עסי מקור דיסקרייבד אויבן.פּעפּטיידז זענען אפגעשיידט אויף געשעפט RP-HPLC פּריקאָלומז (75 μm X 2 סענטימעטער) (טהערמאָ, נומ 164946) און אַנאַליסיס RP-HPLC שפאלטן (75 μm X 25 סענטימעטער) (טהערמאָ, נומ 164941), ביידע אָנגעפילט מיט 2 μם.גראַדיענט פון 8% צו 35% אַקן אין 60 מינוט, און לינעאַרלי געוואקסן צו 98% ב אין 6 מינוט מיט אַ לויפן קורס פון 300 נל / מין.MS ספּעקטראַ (350-1500 עם / ז) זענען געזאמלט מיט אַ האַכלאָטע פון ​​60,000, AGC 4 × 105 און אַ מאַקסימום אַרייַנשרייַב צייט פון 50 מיז.סעלעקטעד ייאַנז זענען סאַקווענטשאַלי פראַגמאַנטיד דורך הקד אין 3 s סייקאַלז מיט אַ נאָרמאַלייזד צונויפשטויס ענערגיע פון ​​30%, אַ קוואַדרופּאָלע אפגעזונדערטקייט פֿענצטער פון 1.6 עם / ז, און אַ האַכלאָטע פון ​​15000. א 5 × 104 טאַנדאַם מאַסע ספּעקטראָומער אַגק ציל און אַ מאַקסימום ינדזשעקשאַן צייט פון 22 מיז זענען געניצט.די דינאַמיש יקסקלוזשאַן איז באַשטימט צו 45 סעקונדעס. ונסאַסיינד ייאַנז אָדער יענע מיט אַ אָפּצאָל פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS. ונסאַסיינד ייאַנז אָדער יענע מיט אַ אָפּצאָל פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ און >7+ отклонены для МС/МС. ונסאַסיינד ייאַנז אָדער ייאַנז מיט אַ אָפּצאָל פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ און >7+ отклонены для МС/МС. ונספּעסיפיעד ייאַנז אָדער ייאַנז מיט טשאַרדזשיז פון 1+ און> 7+ זענען פארווארפן פֿאַר MS / MS.
די מוסטער צוגרייטונג סטעפּס אַרויף צו די ענריטשמענט פון די נעוטראַווידין קרעלן זענען די זעלבע ווי אין די LC-MS / MS אַנאַליסיס דיסקרייבד אויבן.בעערעך 50 μג ליסאַטע איז געניצט ווי אַרייַנשרייַב פֿאַר לאָודינג קאָנטראָל און 2 מג ליסאַטע איז געניצט פֿאַר גיט ריאַקשאַנז.נאָך ענריטשמענט און וואַשינג מיט נעוטראַווידין, די געבונדן פּראָטעינס זענען ילוייטיד דורך אַדינג 50 μל פון לאַעממלי ס באַפער צו די אַגאַראָסע סמאָלע קרעלן און בוילינג בייַ 95 ° סי פֿאַר 5 מינוט.קאָנטראָל מאַסע אַרייַנשרייַב און קרעל ענריטשט סאַמפּאַלז זענען אַנאַלייזד דורך SDS-PAGE און טראַנספערד צו PVDF מעמבריינז (Millipore, #ISEQ00010) דורך נאָרמאַל מערב בלאָט מעטהאָדס.די מעמבריינז זענען אפגעשטעלט מיט 5% אָפּשעפּן מילך (Sangon, #A600669) אין טבס מיט 0.1% טוועען-20 (TBST) און ינקובייטיד סאַקווענטשאַלי מיט ערשטיק און צווייטיק אַנטיבאָדיעס.ערשטיק אַנטיבאָדיעס זענען דיילוטאַד 1:1000 אין 5% אָפּשעפּן מילך אין טבסט און ינקובייטיד יבערנאַכטיק ביי 4 °C.צווייטיק אַנטיבאָדיעס זענען געניצט אין אַ פאַרהעלטעניש פון 1:5000 און ינקובייטיד פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור.די מעמבריינז זענען וויזשוואַלייזד דורך טשעמילומינעסענסע ניצן די Chemidoc MP ימאַגינג סיסטעם.אַלע אַנקוט סקאַנז פון בלאַץ און דזשעלז אין די פיגור זענען דערלאנגט ווי רוי דאַטן.
ערשטיק אַנטיבאָדיעס געניצט אין דעם לערנען אַרייַנגערעכנט קיניגל אַנטי-SFPQ מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (CST, נומ 71992), קיניגל אַנטי-FUS מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (CST, נומ 67840), קיניגל אַנטי-NSUN2 פּאָליקלאָנאַל אַנטיבאָדי (פּראָטעינטעט, נומ - 20854-1) AP), קיניגל אַנטי-מסינ3אַ פּאָליקלאָנאַל אַנטיבאָדי (אַבקאַם, #אַב3479), מויז אַנטי-קוויגל מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (טראַנסגען, #HT201-02), מויז אַנטי-β-אַקטין מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (טראַנסגען, #HC201-01), קיניגל אַנטי -CDK2 מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (ABclonal, #A0094), קיניגל מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי צו CTBP1 (ABclonal, #A11600), קיניגל פּאָליקלאָנאַל אַנטיבאָדי צו DUT (ABclonal, #A2901), קיניגל פּאָליקלאָנאַל אַנטיבאָדי צו PS54, #A250 DNAJB1 פּאָליקלאָנאַל אַנטיבאָדי (ABclonal, # A5504).די אַנטיבאָדיעס זענען געניצט אין אַ 1:1000 דיילושאַן אין 5% אָפּשעפּן מילך אין טבסט.די צווייטיק אַנטיבאָדיעס געניצט אין דעם לערנען אַרייַנגערעכנט אַנטי-קיניגל יגג (טראַנסגען, #HS101-01), אַנטי-מויז יגג (טראַנסגען, #HS201-01) אין אַ דיילושאַן פון 1:5000.
צו ווייַטער פאָרשן צי BRD4 ינטעראַקץ מיט SFPQ, סטאַביל HEK293T און BRD4-miniSOG סעלז וואָס אָוווערעקספּרעסינג HEK293T זענען פּלייטאַד אין 10 סענטימעטער קיילים.סעלז זענען געוואשן מיט קאַלט פּבס און ליסעד אין 1 מל Pierce IP ליסיס באַפער (טערמאָ פישער, #87787) מיט עדטאַ-פֿרייַ פּראָטעאַסע ינכיבאַטער פֿאַר 30 מינוט ביי 4 °C.נאָך דעם, די ליסאַטעס זענען געזאמלט אין 1.5 מל סענטריפודזש טובז און סענטריפוגעד ביי 15,871 קגס פֿאַר 10 מינוט בייַ 4 °C.די סופּערנאַטאַנט איז כאַרוואַסטיד און ינקובייטיד מיט 5 μג פון אַנטי-V5 מיטן נאָמען מויז מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (CST, #80076) יבערנאַכטיק ביי 4 °C.וואַשן בעערעך 50 μל פון פּראָטעין א / ג מאַגנעטיק קרעלן (MCE, #HY-K0202) צוויי מאָל מיט PBS מיט 0.5% טוועען-20.דערנאָך די צעל ליסיז זענען ינקובייטיד מיט מאַגנעטיק קרעלן פֿאַר 4 שעה בייַ 4 ° C מיט ראָוטיישאַן פון דנאָ צו שפּיץ.דערנאָך די קרעלן זענען געוואשן פיר מאל מיט 1 מל פון פּבסט באַפער און בוילד בייַ 95 ° C פֿאַר 5 מינוט.סאַמפּאַלז זענען אַנאַלייזד אויף SDS-PAGE דזשעלז און טראַנספערד צו PVDF מעמבריינז מיט נאָרמאַל מערב בלאָט מעטהאָדס.די מעמבריינז זענען אפגעשטעלט אין 5% אָפּשעפּן מילך אין טבסט און ינקובייטיד סאַקווענטשאַלי מיט ערשטיק און צווייטיק אַנטיבאָדיעס.ערשטיק אַנטיבאָדי ראַבאַט אַנטי-ספפּק מאָנאָקלאָנאַל אַנטיבאָדי (CST, #71992) איז געניצט אין אַ פאַרהעלטעניש פון 1:1000 אין 5% אָפּשעפּן מילך אין טבסט און ינקובייטיד יבערנאַכטיק ביי 4 °C.אַנטי-קיניגל יגג איז געניצט אין אַ פאַרהעלטעניש פון 1:5000 און ינקובייטיד פֿאַר 1 שעה אין צימער טעמפּעראַטור.די מעמבריינז זענען וויזשוואַלייזד דורך טשעמילומינעסענסע ניצן די Chemidoc MP ימאַגינג סיסטעם.
אַלע סטראַקטשערז געניצט פֿאַר די סאַלוואַנט אַקסעסאַבאַל ייבערפלאַך שטח (SASA) אַנאַליסיס זענען באקומען פון די פּראָטעין דאַטאַ באַנק (PDB) 52 אָדער די AlphaFold פּראָטעין סטראַקטשער דאַטאַבאַסע 53.אַבסאָלוט סאַסאַ איז קאַלקיאַלייטיד פֿאַר יעדער רעזאַדו מיט די FreeSASA פּראָגראַם.בלויז פולשטענדיק און אַנאַמביגיואַס SASA דאַטן פֿאַר מיטן נאָמען היסטידינע און זייַן שכנים זענען געניצט צו באַקומען די דורכשניטלעך SASA פֿאַר יעדער סטרוקטור.די קאָרעוו סאַלוואַנט אַקסעסאַביליטי (RSA) פֿאַר יעדער היסטידינע איז קאַלקיאַלייטיד דורך דיוויידינג די אַבסאָלוט סאַסאַ ווערט דורך די עמפּיריקאַל מאַקסימום מעגלעך רעזאַדו ייבערפלאַך געגנט בנימצא צו די סאַלוואַנט.אַלע כיסטידינעס זענען דעמאָלט קלאַסאַפייד ווי פאַרבאָרגן אויב די דורכשניטלעך RSA איז אונטער 20%, אַנדערש יקספּאָוזד 56.
רוי טעקעס באקומען אין DDA מאָדע זענען געזוכט מיט פּראָטעאָמע דיסקאָווערער (וו 2.5) אָדער MSfragger (Fragpipe v15.0) אין די צונעמען SwissProt וועראַפייד פּראָטעין דאַטאַבייס מיט פּראָסט קאַנטאַמאַנאַנץ.די פּעפּטיידז פארלאנגט גאַנץ טריפּסין מיט צוויי פעלנדיק קלעאַוואַגע זייטלעך, קאַרבאַמאָיל מעטהילאַטיאָן ווי אַ פאַרפעסטיקט מאָדיפיקאַטיאָן און מעטהיאָנינע אַקסאַדיישאַן ווי אַ דינאַמיש מאָדיפיקאַטיאָן.פּריקערסער און פראַגמענט וואָג טאָלעראַנץ זענען באַשטימט צו 10 פּפּם און 0.02 דאַ (מס 2 אָרביטראַפּ), ריספּעקטיוולי. קאַנטאַמאַנאַנט היץ זענען אַוועקגענומען, און פּראָטעינס זענען פילטערד צו באַקומען אַ פאַלש ופדעקונג קורס פון <1%. קאַנטאַמאַנאַנט היץ זענען אַוועקגענומען, און פּראָטעינס זענען פילטערד צו באַקומען אַ פאַלש ופדעקונג קורס פון <1%. וויסנשאפטלעכע באַציונגען מיט די יוטאַלאַזיישאַן, און עטלעכע אָפפיסעמענץ, האָבן אַ קאַנסאַנטריישאַן פון <1%. קאַנטאַמאַנאַנט היץ זענען אַוועקגענומען און פּראָטעינס פילטערד צו געבן אַ פאַלש דיטעקשאַן קורס פון <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率. וויסנשאפטלעכע וויסנשאפטלעכע באַציונגען קענען זיין געראָטן, און פילע אָפאַסאַז פֿאַר קאַנסאַנטריישאַן פון יו. עס. <1%. קאַנטאַמאַנאַנט היץ זענען אַוועקגענומען און פּראָטעינס פילטערד צו דערגרייכן אַ פאַלש positive קורס פון <1%.פֿאַר קוואַנטיטאַטיווע אַנאַליסיס אָן די נוצן פון לאַבעלס, נאָרמאַלייזד פּראָטעין אינהאַלט פון דריי בייאַלאַדזשיקאַל ריפּיץ איז געניצט.אַנאַליסיס פון פּראָטעין סובסעללולאַר לאָוקאַלאַזיישאַן איז דורכגעקאָכט מיט גענע אָנטאָלאָגי (GO) אַנאַליסיס פון DAVID ביאָינפאָרמאַטיקס רעסאָורסעס, MitoCarta 3.0 און דאַטאַבייסיז צונויפגעשטעלט און ארויס דורך די Alice Ting גרופּע.די ווולקאַן מאַפּע איז באקומען פון פּערסעוס (v1.6.15.0). ענדערונגען אין די פאַרלייגן פון פּראָטעין שעפע זענען טעסטעד פֿאַר סטאַטיסטיש באַטייַט ניצן אַ צוויי-סיידאַד ה-פּרובירן, און פּראָטעין היץ זענען יידענאַפייד מיט שעפע טוישן> 2 (סייַדן אַנדערש סטייטיד) און פּ ווערט <0.05. ענדערונגען אין די פאַרלייגן פון פּראָטעין שעפע זענען טעסטעד פֿאַר סטאַטיסטיש באַטייַט ניצן אַ צוויי-סיידאַד ה-פּרובירן, און פּראָטעין היץ זענען יידענאַפייד מיט שעפע טוישן> 2 (סייַדן אַנדערש סטייטיד) און פּ ווערט <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. ענדערונגען אין די פאַרלייגן פון פּראָטעין אינהאַלט זענען טעסטעד פֿאַר סטאַטיסטיש באַטייַט ניצן אַ צוויי-טיילד ה-פּרובירן, און פּראָטעין שוועבעלעך זענען יידענאַפייד מיט אינהאַלט טוישן> 2 (סייַדן אַנדערש אנגעוויזן) און אַפּ ווערט <0.05.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍数 变化 统计 统计 统计 统计 蛋白质 蛋白质 蛋白质 命 命 中 的 的 丰度 丰度 丰度 丰度> 2 (除非 另 有 有) 有)) 有使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 的 显着性 显着性 确定 蛋白质 蛋白质 命 命 中 的 的 丰度 丰度 丰度 丰度> 2 (另 有 说明) 说明 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. סטאַטיסטיש באַטייַט פון פאַרלייגן ענדערונגען אין פּראָטעין אינהאַלט איז טעסטעד מיט אַ צוויי-טיילד ה-פּרובירן, און פּראָטעין שוועבעלעך זענען באשלאסן פֿאַר אינהאַלט ענדערונגען> 2 (סייַדן אַנדערש אנגעוויזן) און פּ-וואַלועס <0.05.פּראָטעין ינטעראַקשאַן אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט מיט GO אַנאַליסיס צוזאמען מיט די סטרינג דאַטאַבייס.
דריי בייאַלאַדזשיקאַל רעפּלאַקייטן זענען דורכגעקאָכט מיט ענלעך רעזולטאַטן.סטאַטיסטיש אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט מיט GraphPad Prism (GraphPad ווייכווארג) און ווולקאַן פּלאַץ זענען דזשענערייטאַד מיט Perseus (v1.6.15.0).צו פאַרגלייַכן די צוויי גרופּעס, פּ-וואַלועס זענען באשלאסן מיט אַ צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן.בלויז סינגלעטאָן פּראָטעינס יידענאַפייד אין מינדסטער צוויי מאָל אין דער יקספּערמענאַל גרופּע זענען אַרייַנגערעכנט אין די ווולקאַן פּלאַץ, און די קאָראַספּאַנדינג פעלנדיק וואַלועס אין די קאָנטראָל גרופּע זענען ריפּלייסט מיט פּערסעוס פֿון אַ נאָרמאַל פאַרשפּרייטונג אַזוי אַז די פּ-ווערט קען זיין קאַלקיאַלייטיד.טעות באַרס פאָרשטעלן די דורכשניטלעך ± נאָרמאַל דיווייישאַן.אין פּראָטעאָמיק אַנאַליזעס פֿאַר סטאַטיסטיש אַנאַליסיס, די שעפע פון ​​פּראָטעינס וואָס איז ארויס אין לפּחות צוויי בייאַלאַדזשיקאַל רעפּלאַקאַז איז ריטיינד.סטאַטיסטיש מעטהאָדס זענען נישט געניצט צו פאַר - באַשטימען די מוסטער גרייס.די יקספּעראַמאַנץ זענען נישט טראַפ.די ריסערטשערז זענען נישט בלינד צו די טאַסקס בעשאַס דער עקספּערימענט און אפשאצונג פון די רעזולטאַטן.
פֿאַר מער אינפֿאָרמאַציע וועגן לערנען פּלאַן, זען די אַבסטראַקט נאַטורע פאָרשונג באריכט לינגקט צו דעם אַרטיקל.
די מאַסע ספּעקטראָמעטרי דאַטן באקומען אין דעם לערנען איז געווען דערלאנגט צו די פּראָטעאָמעקסטשאַנגע קאָנסאָרטיום דורך די iProX57 שוטעף ריפּאַזאַטאָרי אונטער דאַטאַסעט שייַן PXD034811 (PDPL-MS דאַטאַסעט).רוי דאַטן זענען צוגעשטעלט אין די פאָרעם פון רוי דאַטן טעקעס.דער אַרטיקל גיט די אָריגינעל דאַטן.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. באַקומען צו וויסן דעם קוואַרטאַל: ניצן פּראַקסימאַטי-אָפענגיק ביאָטינילאַטיאָן צו קעראַקטערייז פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און מאַפּע אָרגאַנאַלז. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. באַקומען צו וויסן דעם קוואַרטאַל: ניצן פּראַקסימאַטי-אָפענגיק ביאָטינילאַטיאָן צו קעראַקטערייז פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און מאַפּע אָרגאַנאַלז.Gingras, AS, Abe, KT און Raut, B. פאַמיליעראַטי מיט סוויווע: ניצן פּראַקסימאַטי-אָפענגיק ביאָטינילאַטיאָן צו קעראַקטערייז פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און מאַפּע אָרגאַנאַלז. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. פֿאַרשטיין דעם קוואַרטאַל: נוצן די קוואַרטאַל ס אָפענגיקייַט אויף בייאַלאַדזשיקאַל לעבן.Gingras, AS, Abe, KT און Raut, B. פארשטאנד פּראַקסימאַטי: כאַראַקטעריזיישאַן פון פּראָטעין קאַמפּלעקסאַז און מאַפּינג פון אָרגאַנאַלז ניצן פּראַקסימאַטי-אָפענגיק ביאָטינילאַטיאָן.קראַנט.מיין מיינונג.כעמישער.ביאָלאָגי 48, 44-54 (2019).
גערי, דזשב עט על.מאַפּינג די מיקראָענוויראָנמענט דורך טראַנספערינג דעקסטער ענערגיע צו ימיון סעלז.וויסנשאַפֿט 367, 1091-1097 (2020).
הערלינג, על עט על.צוויי-פּראָטעאָמע וואָג נעטוואָרקס דעטעקט צעל-ספּעציפיש רימאַדלינג פון די מענטש ינטעראַקטאָמע.סעלז 184, 3022-3040.e3028 (2021).