נייַעס

דאנק איר פֿאַר באזוכן Nature.com.דער בלעטערער ווערסיע איר נוצן האט לימיטעד CSS שטיצן.פֿאַר דער בעסטער דערפאַרונג, מיר רעקאָמענדירן אַז איר נוצן אַ דערהייַנטיקט בלעטערער (אָדער דיסייבאַל קאַמפּאַטאַבילאַטי מאָדע אין Internet Explorer).אין דער דערווייל, צו ענשור פארבליבן שטיצן, מיר וועלן מאַכן דעם פּלאַץ אָן סטיילז און דזשאַוואַסקריפּט.
ראַק סעלז האָבן יוואַלווד פאַרשידן מעקאַניזאַמז צו באַקומען סעליאַלער דרוק און פאָרזעצן צו פּראָגרעס.פּראָטעין קינאַסע ר (PKR) און זייַן פּראָטעין אַקטיוואַטאָר (PACT) זענען די ערשט ריספּאַנדערז וואָס מאָניטאָר פאַרשידן דרוק סיגנאַלז וואָס פירן צו ינאַבישאַן פון צעל פּראָוליפעריישאַן און אַפּאָפּטאָסיס.אָבער, די רעגולירן פון די PACT-PKR פּאַטוויי אין ראַק סעלז בלייבט לאַרגעלי אומבאַקאַנט.דאָ, מיר געפֿונען אַז לאַנג ניט-קאָדינג רנאַ (לנקרנאַ) אַספּאַרטיל טרנאַ סינטעטאַסע אַנטיסענסע רנאַ 1 (DARS-AS1) איז גלייַך ינוואַלווד אין די ינאַבישאַן פון די PACT-PKR פּאַטוויי און פּראַמאָוץ ראַק צעל פּראָוליפעריישאַן.מיט גרויס-וואָג פאַנגקשאַנאַל זיפּונג פון CRISPRI 971 ראַק-פֿאַרבונדן לנקרנאַ, מיר געפֿונען אַז DARS-AS1 איז געווען פֿאַרבונדן מיט באטייטיק ענכאַנסט ראַק צעל פּראָוליפעריישאַן.דעריבער, DARS-AS1 נאַקאַוט ינכיבאַץ צעל פּראָוליפעריישאַן און פּראַמאָוץ ראַק צעל אַפּאָפּטאָסיס אין פאַרשידן ראַק צעל שורות אין וויטראָ און באטייטיק ראַדוסאַז אָנוווקס וווּקס אין וויוואָו.מעטשאַניקאַללי, DARS-AS1 ביינדז גלייך צו די PACT אַקטאַוויישאַן פעלד און פּריווענץ PACT-PKR ינטעראַקשאַן, דערמיט רידוסינג PKR אַקטאַוויישאַן, eIF2α פאָספאָרילאַטיאָן און ינכיבאַטינג אַפּאָפּטאָטיק צעל טויט.קליניקאַלי, DARS-AS1 איז וויידלי אויסגעדריקט אין קייפל קאַנסערץ, און אָוווערעקספּרעססיאָן פון דעם LncRNA איז ינדיקאַטיוו פון אַ נעבעך פּראָגנאָסיס.דעם לערנען ילוסידייץ ראַק-ספּעציפיש רעגולירן פון די PACT-PKR פּאַטוויי דורך DARS-AS1 lncRNA און גיט אן אנדער ציל פֿאַר ראַק פּראָגנאָסיס און באַהאַנדלונג.
די פיייקייט צו אַדאַפּט צו דרוק איז אַ וויכטיק כאַראַקטעריסטיש פון ראַק צעל ניצל און פּראָוליפעריישאַן.די גיך פּראָוליפעריישאַן און מעטאַבאַליק כאַלמאַרקס פון ראַק שפּיץ אין האַרב מיקראָענוויראָנמענץ - נוטריאַנט דעפּראַוויישאַן, היפּאָקסיאַ און נידעריק ף - וואָס קענען צינגל צעל טויט סיגנאַלינג פּאַטווייז.דיסרגולאַטיאָן פון דרוק-שפּירעוודיק גענעס אַזאַ ווי פּ535, היץ שאָק פּראָטעינס 6, 7, KRAS8, 9 און HIF-110, 11, 12, 13 איז אָפט באמערקט אין ראַק, דערמיט בלאַקינג אַפּאָפּטאָסיס און פּראַמאָוטינג ניצל.
פּראָטעין קינאַסע ר (PKR) איז אַ וויכטיק דרוק סענסער און סובוניט קינאַסע פון ​​עוקאַריאָטיק ינישייישאַן פאַקטאָר 2α (eIF2α), אַ איבערזעצונג רעגולאַטאָר וואָס פֿאַרבינדט סעליאַלער דרוק צו צעל טויט.PKR איז ערידזשנאַלי יידענאַפייד ווי אַן אַנטיוויראַל פּראָטעין דורך די דיטעקשאַן פון אַ פרעמד טאָפּל-סטראַנדיד רנאַ (דסרנאַ).נאָך אַקטאַוויישאַן, PKR פאָספאָרילאַטעס eIF2α צו ינכיבאַט די סינטעז פון וויראַל און סעליאַלער פּראָטעין 14,15,16.PACT (PKR אַקטיוואַטאָר פּראָטעין) איז יידענאַפייד ווי דער ערשטער PKR אַקטיוואַטאָר פּראָטעין אין דער אַוועק פון dsRNA17,18,19,20,21,22,23.דורך דירעקט ינטעראַקשאַן מיט PKR, PACT טראַנסדוסיז פאַרשידן סטרעסאַז (סערום הונגער, פּעראַקסייד אָדער אַרסעניטע באַהאַנדלונג) צו PKR און דאַונסטרים סיגנאַלינג פּאַטווייז.אין אַדישאַן צו eIF2α פאָספאָרילאַטיאָן, PACT-מעדיאַטעד PKR אַקטאַוויישאַן טריגערז פאַרשידן געשעענישן פֿאַרבונדן מיט די דרוק ענטפער, אַרייַנגערעכנט אָלטערד רעדאָקס סטאַטוס דורך די PI3K/Akt24 פּאַטוויי, ענכאַנסט דנאַ שעדיקן קאָנטראָלירונג דורך p5325,26 און NF-κB27,28 רעגיאַלייץ טראַנסקריפּציע, 29. געגעבן זייער קריטיש ראָלע אין דרוק ענטפער, פּראָוליפעריישאַן, אַפּאָפּטאָסיס און אנדערע שליסל סעליאַלער פּראַסעסאַז, PKR און PACT זענען פּראַמאַסינג טעראַפּיוטיק טאַרגאַץ פֿאַר פילע חולאתן, ספּעציעל ראַק30,31,32,33.אָבער, טראָץ דעם פּלעיאָטראָפּיק פאַנגקשאַנאַל און בייאַלאַדזשיקאַל באַטייַט, די רעגולירן פון PACT / PKR טעטיקייט אין ראַק סעלז בלייבט ילוסיוו.
lncRNAs זענען טראַנסקריפּץ גרעסער ווי 200 נוקלעאָטידעס מיט קיין פּראָטעין-קאָדינג פּאָטענציעל.זינט קאַטינג-ברעג גאַנץ גענאָמע סיקוואַנסינג פּראַדזשעקס האָבן יידענאַפייד טויזנטער פון לנקרנאַס, 35,36 פיל מי איז געמאכט צו דערקלערן זייער בייאַלאַדזשיקאַל פאַנגקשאַנז.א גראָוינג גוף פון פאָרשונג האט געוויזן אַז ינקרנאַ זענען ינוואַלווד אין פילע בייאַלאַדזשיקאַל פּראַסעסאַז37 אַרייַנגערעכנט די רעגולירן פון X-טשראָמאָסאָם ינאַקטיוויישאַן38,39, ימפּרינטינג40, טראַנסקריפּציע41,42, איבערזעצונג43 און אפילו ראַק וווּקס44,45,46,47.די שטודיום האָבן געמאלדן אַז פילע ינקרנאַס זענען ינוואַלווד אין די PACT / PKR פּאַטוויי.איין אַזאַ לערנען געוויזן אַז lncRNA ASPACT ינכיבאַטיד PACT טראַנסקריפּציע און געוואקסן יאָדער ריטענשאַן פון PACT mRNA.אנדערע שטודיום האָבן געוויזן אַז lncRNA nc886 ביינדז צו PKR און ינכיבאַץ זייַן פאָספאָרילאַטיאָן 49,50.ביז איצט, lncRNA רעגיאַלייטינג PACT-מעדיאַטעד PKR אַקטאַוויישאַן איז נישט רעפּאָרטעד.
אַספּאַרטיל-טרנאַ סינטעטאַסע אַנטיסענסע רנאַ 1 (DARS-AS1) איז יידענאַפייד ווי אַן אָנקאָגעניק ינקרנאַ51,52,53,54.דורך די רעגולירן פון miP-194-5p53, miP-12952 און miP-532-3p51, DARS-AS1 איז געוויזן צו העכערן דעם וווּקס פון קלאָר צעל רענאַל צעל קאַרסינאָמאַ, טיירויד קאַרסינאָמאַ און ניט-קליין צעל לונג קאַרסינאָמאַ ריספּעקטיוולי.טאָנג און קאָלעגעס אויך געפֿונען אַז DARS-AS1 פּראַמאָוץ מיעלאָמאַ פּראַגרעשאַן דורך מיינטיינינג די פעסטקייַט פון די פּראָטעין 39 (RBM39) רנאַ-ביינדינג מאָטיוו.אָבער, קיין שטודיום האָבן שוין געפירט אויף צי דעם lncRNA איז ינוואַלווד אין די רעגולירן פון PACT-PKR אַקטאַוויישאַן און די דרוק ענטפער פון ראַק סעלז.
דאָ, מיר דורכגעקאָכט אַ גרויס-וואָג אָנווער-פון-פונקציע פאַרשטעלן ניצן די CRISPRI סיסטעם און באשלאסן אַז DARS-AS1 lncRNA פּראַמאָוץ די פּראָוליפעריישאַן פון עטלעכע טייפּס פון ראַק סעלז.אין אַדישאַן, מיר האָבן יידענאַפייד אַ הויפּט מעקאַניזאַם: DARS-AS1 ביינדז גלייך צו PACT, ינכיבאַץ PACT און PKR ביינדינג, פּריווענץ פאָספאָרילאַטיאָן פון eIF2α, אַ נידעריקער PKR סאַבסטרייט, און לעסאָף ינכיבאַץ אַפּאָפּטאָטיק צעל טויט.אין מסקנא, אונדזער אַרבעט ריווילז די DARS-AS1 lncRNA ווי אַ רעגולאַטאָר פון די PACT-PKR פּאַטוויי און אַ פּאָטענציעל ציל פֿאַר ראַק באַהאַנדלונג און פּראָגנאָסיס.
ברייט גענאָמיק פּראָפילינג שטודיום האָבן יידענאַפייד הונדערטער פון לנקרנאַ פֿאַרבונדן מיט ראַק.אָבער, זייער פֿונקציע איז לאַרגעלי אומבאַקאַנט56.צו ידענטיפיצירן פּראַמאַסינג לנקרנאַ קאַנדאַדייץ ינוואַלווד אין ראַק פּראַגרעשאַן, מיר דורכגעקאָכט אַ אָנווער-פון-פונקציע פאַרשטעלן פֿאַר רידוסט פּראָוליפעריישאַן אין די SW620 קאָלאָרעקטאַל ראַק צעל ליניע ניצן די CRISPRI סיסטעם (Fig. 1 אַ).די יינציק שטריך פון די SW480 און SW620 צווייפּינטל ראַק צעל שורות איז אַז זיי זענען דערייווד פון ערשטיק און צווייטיק טומאָרס אין אַ איין פּאַציענט.דאָס גיט אַ ווערטפול פאַרגלייַך פֿאַר לערנען גענעטיק ענדערונגען אין די פּראַגרעשאַן פון אַוואַנסירטע צווייפּינטל ראַק.דעריבער, מיר אַנאַלייזד די טראַנסקריפּטאָמעס פון קאָלאָרעקטאַל ראַק צעל שורות (SW480 און SW620) ניצן רנאַ סיקוואַנסינג און געזאמלט עטלעכע פּאָטענציעל פאַנגקשאַנאַל לנקרנאַס פון די ארויס ליטעראַטור.באַזירט אויף די רעזולטאַטן, מיר דיזיינד אַ פּאָאָלעד סגרנאַ ביבליאָטעק מיט 7355 סגרנאַ אָליגאָס טאַרגאַטינג 971 ראַק-פֿאַרבונדן לנקרנאַ און 500 אַנטאַרגעט סגרנאַ אָליגאָס פֿאַר אַ נעגאַטיוו קאָנטראָל (סופּפּלעמענטאַרי דאַטאַ 1).
סכעמאַטיש פאַרטרעטונג פון זיפּונג ניצן די CRISPRI סיסטעם.b sgRNA ענריטשמענט נאָך זיפּונג.די האָריזאָנטאַל דאַטיד שורה רעפּראַזענץ לאָג2 (פאַרלייגן טוישן) = ± 0.58.די ווערטיקאַל דאַטיד שורה ינדיקייץ פּ ווערט = 0.05.שוואַרץ דאַץ רעפּראַזענץ ניט-ציל סגרנאַ (דעזיגנייטיד ווי NC).רויט דאַץ זענען סגרנאַ טאַרגאַטינג DARS-AS1.בלוי דאַץ זענען סגרנאַ טאַרגאַטינג LINC00205, אַ פריער דיסקרייבד אָנקאָגעניק לנקרנאַ.פאַרלייגן טוישן = (נאָרמאַלייזד לייענען, טאָג 17) / (נאָרמאַלייזד לייענען, טאָג 0).c DARS-AS1 sgRNA נאַקדאַון ינכיבאַטיד צעל גראָוט.טעות באַרס פאָרשטעלן ± נאָרמאַל דיווייישאַן פון די דרייַ יקספּעראַמאַנץ.* פּ ≤ 0.05, ** פּ ≤ 0.01 צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן.d DARS-AS1 אויסדרוק אין טומאָרס (TCGA דאַטאַסעט).עם עקספּרעססיאָן פון DARS-AS1 אין פּערד נאָרמאַל און אָנוווקס סאַמפּאַלז פון פּאַטיענץ מיט BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP און COAD, ריספּעקטיוולי (TCGA דאַטאַסעט).פּ-וואַלועס זענען באקומען מיט אַ פּערד צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן.
נאָך קאַנסטראַקטינג די פּלאַזמיד און פּאַקקאַגינג די לענטיווירוס, מיר טראַנסדוסט די dCas9-SW620 קאָלאָרעקטאַל ראַק צעל שורה מיט די אויבן ביבליאָטעק אין פיר פרייַ ינפעקציע יקספּעראַמאַנץ.די קייפל פון ינפעקציע (MOI) פֿאַר די ינפעקשאַנז איז געווען 0.1-0.3, וואָס ינדיקייץ אַז יעדער צעל קענען זיין טראַנספעקטעד בלויז מיט איין סגרנאַ.נאָך 18 טעג פון אין וויטראָ קולטור, די ענריטשמענט פּראָפיל פון ציל sgRNAs דיקריסט אָדער געוואקסן נאָך זיפּונג, בשעת די נומער פון ניט-טאַרגעטעד קאָנטראָל אָליגאָנוקלעאָטידעס פארבליבן לעפיערעך אַנטשיינדזשד קאַמפּערד מיט די פאַר-זיפּונג פּראָפיל, וואָס ינדיקייץ אַז אונדזער ציל האט אַ העכסט פאַרשטעלן-ספּעציפיש. ביבליאָטעק.רייס.1ב און סאַפּלאַמענטערי טיש 1). LINC00205, וואָס איז געווען פריער רעפּאָרטעד צו העכערן לונג ראַק און לעבער ראַק פּראַגרעשאַן 58, 59, 60, איז געווען סקרינד אויס (לאָג 2 (פאָולדטשאַנגע) <-0.58, פּ ווערט < 0.05), קאַנפערמינג די רילייאַבילאַטי פון דעם זיפּונג (Fig. 1 ב). LINC00205, וואָס איז געווען פריער רעפּאָרטעד צו העכערן לונג ראַק און לעבער ראַק פּראַגרעשאַן 58, 59, 60, איז געווען סקרינד אויס (לאָג 2 (פאָולדטשאַנגע) <-0.58, פּ ווערט < 0.05), קאַנפערמינג די רילייאַבילאַטי פון דעם זיפּונג (Fig. 1 ב). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1ב). LINC00205, ביז אַהער געמאלדן צו העכערן די פּראַגרעשאַן פון לונג ראַק און לעבער ראַק58,59,60, איז געווען יקסקלודיד (לאָג2 (פאַרלייגן ענדערונג) <-0.58, פּ-ווערט <0.05), קאַנפערמינג די ראָובאַסטנאַס פון דעם זיפּונג (Fig. .1b) . LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205 之前被报道可促进肺癌和肝癌进展58,59,60，被筛选掉（log2（倍数变化）< -0.58，p 值< 0.05），证实了该筛选的可靠性（图1b）。 LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис 1ב). LINC00205, ביז אַהער געמאלדן צו העכערן פּראַגרעשאַן פון לונג און לעבער ראַק58,59,60, איז געווען יקסקלודיד (לאָג2 (פאַרלייגן טוישן) <-0.58, פּ-ווערט <0.05), קאַנפערמינג די ראָובאַסטנאַס פון דעם זיפּונג (Fig. .1b).
צווישן אַלע לנקרנאַ טעסטעד, DARS-AS1 איז אויך סקרינד, מיט די דריי קאָגנאַטע סגרנאַ אָליגאָנוקלעאָטידעס באטייטיק רידוסט נאָך 18 טעג פון קולטור, סאַגדזשעסטינג אַז נאַקדאַון פון דעם לנקרנאַ ריזאַלטיד אין רידוסט ראַק פּראָוליפעריישאַן (Fig. 1b).דער רעזולטאַט איז געווען ווייַטער געשטיצט דורך MTS אַנאַליסיס אין קאָלאָרעקטאַל ראַק סעלז וואָס ווייַזן אַז די גראָוט קורס פון DARS-AS1 נאַקדאַון סעלז איז בלויז כאַווד קאַמפּערד מיט קאָנטראָל סעלז (פיגורע 1c) און איז קאָנסיסטענט מיט פריערדיקע ריפּאָרץ פון עטלעכע אנדערע ראַק טייפּס.: קלאָר צעל ניר ראַק, טיירויד ראַק און ניט-קליין צעל לונג ראַק51,52,53,55.אָבער, זייַן פונקציע און מאָלעקולאַר מעקאַניזאַמז אין קאָלאָרעקטאַל ראַק בלייבן אַניקספּלאָרד.דעריבער, מיר אויסדערוויילט דעם lncRNA פֿאַר ווייַטער לערנען.
צו לערנען DARS-AS1 אויסדרוק אין פּאַטיענץ, מיר פולשטענדיק אַנאַלייזד 10,327 אָנוווקס סאַמפּאַלז פון די קאַנסער גענאָמע אַטלאַס (TCGA) פּרויעקט.אונדזער רעזולטאַטן ווייַזן אַז DARS-AS1 איז וויידלי אויסגעדריקט און באטייטיק אַפּרעגיאַלייטיד אין געזונט סעלז אין אַ פאַרשיידנקייַט פון טומאָרס, אַרייַנגערעכנט צווייפּינטל אַדענאָקאַרזינאָמאַ (COAD), רענאַל קלאָר צעל קאַרסינאָמאַ (KIRC) און רענאַל פּאַפּיללאַרי צעל קאַרסינאָמאַ (KIRP)..זייער ווייניק (פיג. קסנומקסד און סאַפּלאַמענטערי פייג. קסנומקסאַ, ב). אַנאַליסיס פון פּערד געזונט / אָנוווקס סאַמפּאַלז ווייַטער באשטעטיקט אַ באטייטיק העכער אויסדרוק פון DARS-AS1 אין די טומאָרס פון פּענכער וראָטהעליאַל קאַרסינאָמאַ (BLCA), ניר רענאַל קלאָר צעל קאַרסינאָמאַ (KIRC), פּראָסטאַט אַדענאָקאַרזינאָמאַ (PRAD), לונג סקוואַמאָוס צעל קאַרסינאָמאַ (LUSC) , יוטעראַן קאָרפּוס ענדאָמעטריאַל קאַרסינאָמאַ (UCEC), לונג אַדענאָקאַרזינאָמאַ (לואַד), לעבער העפּאַטאָסעללולאַר קאַרסינאָמאַ (ליהק), ניר רענאַל פּאַפּיללאַרי צעל קאַרסינאָמאַ (קירפּ), און צווייפּינטל אַדענאָקאַרזינאָמאַ (COAD) (פּ ווערט <0.05) (פיגורע 1e-עם) . אַנאַליסיס פון פּערד געזונט / אָנוווקס סאַמפּאַלז ווייַטער באשטעטיקט אַ באטייטיק העכער אויסדרוק פון DARS-AS1 אין די טומאָרס פון פּענכער וראָטהעליאַל קאַרסינאָמאַ (BLCA), ניר רענאַל קלאָר צעל קאַרסינאָמאַ (KIRC), פּראָסטאַט אַדענאָקאַרזינאָמאַ (PRAD), לונג סקוואַמאָוס צעל קאַרסינאָמאַ (LUSC) , יוטעראַן קאָרפּוס ענדאָמעטריאַל קאַרסינאָמאַ (UCEC), לונג אַדענאָקאַרזינאָמאַ (לואַד), לעבער העפּאַטאָסעללולאַר קאַרסינאָמאַ (ליהק), ניר רענאַל פּאַפּיללאַרי צעל קאַרסינאָמאַ (קירפּ), און צווייפּינטל אַדענאָקאַרזינאָמאַ (COAD) (פּ ווערט <0.05) (פיגורע 1e-עם) .אַנאַליסיס פון פּערד געזונט / אָנוווקס סאַמפּאַלז אויך באשטעטיקט באטייטיק העכער אויסדרוק פון DARS-AS1 אין פּענכער וראָטהעליאַל קאַרסינאָמאַ (BLCA), קלאָר צעל רענאַל און רענאַל צעל קאַרסינאָמאַ (KIRC), פּראָסטאַט אַדענאָקאַרזינאָמאַ (PRAD), לונג סקוואַמאָוס צעל קאַרסינאָמאַ (LUSC) טומאָרס., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– ם ) . ענדאָמעטריאַל קאַרסינאָמאַ פון די קאָרפּוס יוטערי (UCEC), אַדענאָקאַרזינאָמאַ פון די לונג (LUAD), העפּאַטאָסעללולאַר קאַרסינאָמאַ פון די לעבער (LIHC), פּאַפּיללאַרי צעל קאַרסינאָמאַ פון די ניר (KIRP), און אַדענאָקאַרזינאָמאַ פון די צווייפּינטל (COAD) (פּ ווערט < 0.05) (פיג. 1e- עם) .配对 健康 / 肿瘤样本 的 分析 进一步 证实 dars-AS1 在 膀胱 尿路 尿路 尿路 尿路 上 上 上 上 上 上 上 (בלקאַ), 肾 肾 透明 (קירק), 前列 腺腺癌 (Prad), 肺鳞状 细胞癌 (לוסק) 肺鳞状 中 中显着 更 高 高, 子宫体子宫 内膜 内膜 (UCEC), 肺腺癌 (Luad), 肝肝 细胞癌 (LIHC), 肾 肾 乳头状 乳头状 (קירפּ) 和结肠腺癌 (CIRP) (POD) <0.05）（图1e-m）.配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌 (prad) 、 细胞癌 细胞癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 更 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 高 内膜) 肺腺癌 (luad) 肝肝 肾 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状 乳头状癌 （קירפּ） (קאָאַד) （p 值<0.05）（图1e-m）.אַנאַליסיס פון געזונט / אָנוווקס פּערד סאַמפּאַלז ווייַטער געשטיצט די ראָלע פון ​​​​DARS-AS1 אין פּענכער וראָטהעליאַל קאַרסינאָמאַ (BLCA), קלאָר צעל רענאַל צעל קאַרסינאָמאַ (KIRC), פּראָסטאַט אַדענאָקאַרזינאָמאַ (PRAD), און לונג סקוואַמאָוס צעל קאַרסינאָמאַ (LUSC) טומאָרס.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -ם). אויסדרוק אין קאָרפּוס יוטעראַן קאַרסינאָמאַ (UCEC), לונג אַדענאָקאַרזינאָמאַ (LUAD), העפּאַטאָסעללולאַר קאַרסינאָמאַ (LIHC), רענאַל פּאַפּיללאַרי צעל קאַרסינאָמאַ (KIRP), און צווייפּינטל אַדענאָקאַרזינאָמאַ (COAD) (פּ ווערט <0.05) (פיגורע 1e -ם).צוזאַמען, די רעזולטאַטן אָנווייַזן אַז DARS-AS1 איז וויידלי און העכסט אויסגעדריקט אין אַ פאַרשיידנקייַט פון קאַנסערץ.
ווייַל DARS-AS1 און DARS (די דזשין קאָדירונג די אַנטיסענסע שנירל) טיילן די זעלבע פּראָמאָטער און זענען ליגן לעבן יעדער אנדערער, ​​מיר דיזיינד שרנאַ צו ספּאַסיפיקלי נאַקדאַון DARS-AS1 אָבער נישט דאַרס (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 אַ, ב און סאַפּלאַמענערי טאַבלע 2) .אין אַדישאַן צו SW620, מיר אויך געניצט דריי אנדערע צעל שורות וואָס זענען העכסט יקספּרעסינג DARS-AS1 צו לערנען די עפיקאַסי און פונקציע פון ​​shRNA נאַקדאַון (סופּפּלעמענטאַרי טאַבלע 3).אונדזער רעזולטאטן אנגעוויזן אַז אַלע דריי שרנאַס דעוועלאָפּעד אַטשיווד בייַ מינדסטער 80% דאַרס-אַס1 נאַקדאַון עפעקטיווקייַט מיט קליין ווירקונג אויף די סומע פון ​​דאַרס מרנאַ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2ק-ף).אין אַדישאַן, מיר געפֿונען אַז DARS-AS1 נאַקדאַון מיט די שרנאַ באטייטיק ינכיבאַטיד צעל גראָוט אין קאָלאָרעקטאַל ראַק צעל שורות SW620 (49.7%) און HCT116 (27.7%), ברוסט ראַק צעל ליניע MBA-MD-231 (53.4%).) און די HepG2 העפּאַטאָמאַ צעל שורה (92.7% רעדוקציע), ווי געזונט ווי זייער פיייקייט צו פאָרעם אַנאַנגקערד ספערעס (דורכשניטלעך רעדוקציע פון ​​~ 50.8%, 44.6%, 40.7% און 75.7% פּער צעל שורה) (Fig. 2a,b).אין SW620, די רעזולטאטן פון די קאַלאַני פאָרמירונג אַססייַ נאָך באשטעטיקט אַז DARS-AS1 shRNA באטייטיק ינכיבאַטיד צעל פּראָוליפעריישאַן מיט אַ דורכשניטלעך פאַרקלענערן פון בעערעך 69.6% (Fig. 2c).
ווירקונג פון קאָנטראָל שרנאַ און DARS-AS1 שרנאַ אויף צעל פּראָוליפעריישאַן (אַ) און ספעראָיד פאָרמירונג (ב) אין SW620, HCT116, MBA-MD-231 און HepG2 סעלז.c ווירקונג פון קאָנטראָל שרנאַ און DARS-AS1 שרנאַ אויף קאַלאַני פאָרמירונג אין SW620 סעלז.צעל פּראָוליפעריישאַן (ד), ספעראָיד פאָרמירונג (E), און קאַלאַני פאָרמירונג (F) פון SW620 סעלז אָוווערעקספּרעססינג DARS-AS1.דאַטן געוויזן זענען די דורכשניטלעך ± נאָרמאַל דיווייישאַן פון דרייַ יקספּעראַמאַנץ.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, און *** p ≤ 0.001 דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ג-פּרובירן.
צו דערגאַנג אָנווער-פון-פונקציאָנירן שטודיום, מיר ווייַטער באשאפן SW620 סעלז אָוווערעקספּרעססינג DARS-AS1 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2ג).DARS-AS1 אָוווערעקספּרעססיאָן באטייטיק געוואקסן צעל גראָוט (1.8-פאַרלייגן), אַנאַנגקערד ספעראָיד פאָרמירונג (1.4-פאַרלייגן), און קאַלאַני פאָרמירונג (3.3-פאַרלייגן) אין SW620 סעלז (Fig. 2d-f).מיר באשטעטיקט דעם רעזולטאַט מיט אן אנדער DARS-AS1 יקספּרעסינג צעל שורה, A549.דעם ענכאַנסט צעל פּראָוליפעריישאַן רעכט צו דאַרס-אַס 1 אָוווערעקספּרעססיאָן איז געווען ווייַטער באמערקט אין אַ 549 סעלז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 2 ה, איך און סאַפּלאַמענערי טאַבלע 3).צוזאַמען, די געווינס און אָנווער שטודיום באַווייַזן אַז DARS-AS1 פּראַמאָוץ ראַק צעל פּראָוליפעריישאַן אין וויטראָ.
צו ויספאָרשן די אַנדערלייינג מעקאַניזאַם דורך וואָס DARS-AS1 רעגיאַלייץ צעל פּראָוליפעריישאַן, מיר דורכגעקאָכט אַ רנאַ פּול-אַראָפּ אַנאַליסיס צו ידענטיפיצירן די פּאָטענציעל פּראָטעין-ביינדינג פּאַרטנערס.RT-qPCR רעזולטאַטן געוויזן אַז וועגן 86.2% פון DARS-AS1 איז ליגן אין די סיטאָפּלאַסם פון סוו620 סעלז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3 אַ).די ינ וויטראָ טראַנסקריבעד ביאָטינילאַטעד DARS-AS1 אָדער פּסעודאָרנאַ איז געווען ינקובייטיד מיט SW620 צעל ליסאַטעס נאכגעגאנגען דורך SDS-PAGE צעשיידונג.סאַבסאַקוואַנט זילבער סטיינינג געוויזן אַז אַ בוילעט באַנד (~ 38 kDa) איז באטייטיק ענריטשט אין דאַרס-אַס 1 ציען סאַמפּאַלז אָבער נישט אין באָק רנאַ אָדער קרעלן סאַמפּאַלז (Fig. 3 אַ).דער באַנד איז געווען יידענאַפייד ווי אַ פּקר אַקטאַווייטינג פּראָטעין (PACT) דורך מאַסע ספּעקטראָמעטרי (מס) און ווייַטער באשטעטיקט דורך ימיונאָבלאָטינג אין SW620, HCT116 און HepG2 צעל שורות (Fig. 3a,b).די ענריטשמענט פון DARS און פֿאַרבונדענע PACT פּראָטעינס - PKR און TRBP - איז אויך ינוועסטאַגייטאַד מיט רנאַ אַנאַליסיס דורך מערב בלאָטינג (WB).די רעזולטאַטן אנגעוויזן אַז קיין דירעקט ינטעראַקשאַן צווישן דאַרס-אַס1 רנאַ און די דרייַ פּראָטעינס איז געפונען (סופּפּלעמענטאַרי פייג. קסנומקסב).די ספּעציפיש ינטעראַקשאַן צווישן DARS-AS1 און PACT איז נאָך באשטעטיקט דורך רנאַ ימיונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן (RIP) אַנאַליסיס, וואָס געוויזן אַז DARS-AS1 איז באטייטיק ענריטשט אין אַנטי-PACT אַנטיבאָדיעס אָבער נישט אנדערע קאָנטראָל רנאַס (פיגורע 3c).צו באַשליסן אויב DARS-AS1 ינטעראַקץ גלייך מיט PACT אין דער אַוועק פון קיין אנדערע סעליאַלער קאַמפּאָונאַנץ, אַן ינ וויטראָ ביאָלייַער ינטערפעראָמעטרי (BLI) אַסייַ איז דורכגעקאָכט מיט פּיוראַפייד PACT.ביאָטין-לייבאַלד DARS-AS1 אָדער דאַמי רנאַ איז ימאָובאַלייזד אויף סטרעפּטאַווידין (SA) ביאָסענסאָרס און דעמאָלט ינקובייטיד אין קינעטיק באַפער מיט 1 μM PACT.נאָוטאַבלי, PACT איז שטארק פארבונדן צו DARS-AS1 (KD ווערט ~ 26.9 nM), אָבער נישט צו נאָכקרימען רנאַ (פיגורע 3 ד).צוזאַמען, די רעזולטאַטן באַווייַזן אַ דירעקט ינטעראַקשאַן און הויך קירבות צווישן DARS-AS1 און PACT.
RNA ציען אַנאַליסיס יידענאַפייד DARS-AS1 ינטעראַקטינג מיט PACT אין SW620 סעלז.אויבן, זילבער סטיינינג פון פֿאַרבונדענע פּראָטעינס.נידעריקער ימיונאָבלאָץ זענען דורכגעקאָכט מיט אַנטי-PACT אַנטיבאָדי.ב רנאַ פּול-אַראָפּ אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט אין HCT116 (שפּיץ) און HepG2 (דנאָ) סעלז.PACT ענריטשמענט איז דיטעקטאַד דורך ימיונאָבלאָטינג.קרנאַ יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן (ריפּ) אַסאַסאַז זענען דורכגעקאָכט אין SW620 סעלז מיט די אנגעוויזן אַנטיבאָדיעס.ד PACT ביינדינג קורוועס צו פול-לענג DARS-AS1 אָדער קאָנטראָל רנאַ זענען באקומען מיט ביאָלייַער ינטערפעראָמעטרי (BLI).רנאַ איז ימאָובאַלייזד אויף אַ סטרעפּטאַווידין ביאָסענסאָר.1 μM PACT איז געניצט צו מעסטן פאַרבאַנד.e רנאַ ציען אַססייַ איז דורכגעקאָכט מיט ביאָטינילאַטעד פול-לענג DARS-AS1 אָדער טראַנגקייטיד (שפּיץ).יממונאָבלאָט ווייזונג PACT באקומען (דנאָ).פ פּוריפיעד פלאַגד פּאַקט איז ינגקיובייטיד מיט ביאָטינילאַטעד פול-לענג DARS-AS1 אָדער טראַנגקייטיד (ווי אין E) פֿאַר אין וויטראָ ריפּ אַסייַ.די יקסטראַקטיד רנאַ איז געווען וועראַפייד דורך RT-qPCR.ג די קאָרעוו קירבות פון פאַרשידענע רנאַ פראַגמאַנץ פֿאַר פּאַקט איז באקומען ניצן ביאָלייַער ינטערפעראָמעטרי.פֿאַר אַנאַליסיס, 100 nM RNA און 1 μM RAST זענען געניצט.ה ינ וויטראָ ריפּ אַסייז זענען דורכגעקאָכט מיט פּיוראַפייד בעשאָלעם אָדער טראַנגקייטיד מיט PACT.די יקסטראַקטיד רנאַ איז געווען וועראַפייד דורך RT-qPCR.איך גראָוט קורס פון SW620 סעלז אָוווערעקספּרעססינג DARS-AS1, PACT אָדער ביידע.דזש אָוווערעקספּרעססיאָן פון פול-לענג אָדער טראַנגקייטיד DARS-AS1 אין SW620 סעלז האט פאַרשידענע יפעקץ אויף צעל גראָוט.ק אַפּאָפּטאָסיס איז געווען דיטעקטאַד דורך ימיונאָבלאָטינג מיט אַנטי-PARP אַנטיבאָדי.l נאַקאַוט פון DARS-AS1 ינדוסיז אַפּאָפּטאָסיס פון SW620 סעלז ווי געוויזן דורך לויפן סיטאָמעטרי.דאַטן געוויזן זענען די דורכשניטלעך ± נאָרמאַל דיווייישאַן פון דרייַ יקספּעראַמאַנץ. * פּ ≤ 0.05, ** פּ ≤ 0.01, *** פּ ≤ 0.001, **** פּ < 0.0001, דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ה פּראָבע. * פּ ≤ 0.05, ** פּ ≤ 0.01, *** פּ ≤ 0.001, **** פּ < 0.0001, דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ה פּראָבע. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 פֿאַר אַ פּריוואַט קריטעריוס. * פּ ≤ 0.05, ** פּ ≤ 0.01, *** פּ ≤ 0.001, **** פּ < 0.0001 דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 פֿאַר אַ פּריוואַט קריטעריוס. * פּ ≤ 0.05, ** פּ ≤ 0.01, *** פּ ≤ 0.001, **** פּ < 0.0001 דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן.
דערנאָך, מיר דזשענערייטאַד דריי ביאָטינילאַטעד DARS-AS1 רנאַ פראַגמאַנץ דורך ינ וויטראָ טראַנסקריפּציע צו ידענטיפיצירן די DARS-AS1 געגנט פארלאנגט פֿאַר PACT פאַרבאַנד (פיגורע 3e).די רנאַ אַנאַליסיס רעזולטאטן געוויזן אַז יעדער פראַגמענט איז ביכולת צו ינטעראַקט מיט פּאַקט, אָבער די 3′-וואָקזאַל געגנט (384-768 נוקלעאָטידעס מיטן נאָמען A3) געוויזן מער ווי 1-384 נוקלעאָטידעס מיטן נאָמען A1) (Fig. 3e).ענלעכע רעזולטאטן זענען באמערקט אין די ינ וויטראָ ריפּ אַסיי מיט רעקאָמבינאַנט PACT (פיגורע 3f).קאָנסיסטענט מיט די רעזולטאַטן, יקספּעראַמאַנץ צו בינדן ימאָובאַלייזד רנאַ פראַגמאַנץ צו PACT ניצן BLI אויך געוויזן אַז PACT האט אַ העכער קירבות פֿאַר A3 (384-768 nt) (KD ווערט פון בעערעך 94.6 nM), בשעת כּמעט קיין פֿאַרבינדונגען מיט אנדערע געביטן.(פיג. קסנומקסד).
מיר אויך יגזאַמאַנד די פֿאַרבונדן ביינדינג מקומות אין PACT.PACT כּולל דריי פאַנגקשאַנאַל דאָומיינז, צוויי פון וואָס זענען קאַנסערווד טאָפּל-סטראַנדיד רנאַ-ביינדינג דאָומיינז (דסרבד) און אַ דריט פעלד (דעזיגנייטיד ד 3) וואָס אַקט ווי אַן אַקטיוואַטאָר פון פּראָטעין ינטעראַקשאַנז.צו ונטערזוכן די LncRNA ביינדינג קאַפּאַציטעט פון יעדער פעלד, מיר ענדזשאַנירד דריי מיוטיישאַנז וואָס האָבן אַוועקגענומען יעדער פון די דריי דאָומיינז און דורכגעקאָכט אַן אין וויטראָ RIP אַסייַ.אונדזער רעזולטאטן געוויזן אַז דילישאַן פון די דריט פעלד (D3) פון PACT באטייטיק רידוסט זייַן ינטעראַקשאַן מיט DARS-AS1 (דורך 0.11-פאַרלייגן קאַמפּערד מיט בעשאָלעם PACT) קאַמפּערד מיט די אנדערע צוויי מיוטיישאַנז (Fig. 3h), עס איז געוויזן אַז די מעלדונג. פון D3 ינטעראַקטיד מיט DARS.-AC1.צוזאַמען, די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז ינטעראַקשאַן צווישן DARS-AS1 און PACT קען פּאַסירן בפֿרט דורך די 3′ סוף פון DARS-AS1 און די D3 פעלד פון PACT.
מיר באמערקט אַז דאַרס-אַס1 האט קיין ווירקונג אויף פּאַקט אויסדרוק און פּאַקט האט קיין ווירקונג אויף דאַרס-אַס1 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3ק).מיר דערנאָך יגזאַמאַנד די ווירקונג פון PACT נאַקדאַון אויף צעל גראָוט.אין קאַנטראַסט צו DARS-AS1, קאָרעוו סעלז געוואקסן 1.5-3 מאל פאַסטער ווען פּאַקט איז נאַקט אַראָפּ (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3 ד).די רעזולטאטן פון די קאַלאַני פאָרמירונג אַססייַ אנגעוויזן אַז די סעלז געשאפן 2-3-פאַרלייגן קאָלאָניעס נאָך שרנאַ באַהאַנדלונג מיט פּאַקט (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 3 ע).צו פּרובירן צי DARS-AS1 רעגיאַלייץ צעל פּראָוליפעריישאַן דורך PACT, מיר דזשענערייטאַד SW620 סעלז אָוווערעקספּרעססינג PACT, DARS-AS1 אָדער ביידע.אָווערעקספּרעססיאָן פון PACT געוויזן באַטייַטיק ינאַבישאַן פון צעל פּראָוליפעריישאַן (פיגורע 3i).כאָטש DARS-AS1 אָוווערעקספּרעססיאָן פּער סיי באטייטיק פּראָמאָטעד צעל פּראָוליפעריישאַן, עס איז קיין באַטייטיק חילוק אין די וווּקס קורס פון סעלז אָוווערעקספּרעססינג DARS-AS1 און PACT.די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז PACT קען אַנטקעגנשטעלנ די געוואקסן פּראָוליפעריישאַן געפֿירט דורך DARS-AS1 אָוווערעקספּרעססיאָן.
זינט פאַרשידענע מקומות פון DARS-AS1 האָבן פאַרשידענע PACT-ביינדינג אַבילאַטיז, מיר ינוועסטאַגייטאַד זייער קאָרעוו השפּעה אויף צעל פּראָוליפעריישאַן דורך פאַרשידענע אָוווערעקספּרעססיאָן פון DARS-AS1 פראַגמאַנץ.קאַמפּערד צו די אנדערע צוויי פראַגמאַנץ, DARS-AS1 איז אָוווערעקספּרעססעד אין די 3′ סוף (384-768 nt), די הויפּט PACT-פֿאַרבונדענע געגנט אין DARS-AS1, וואָס האט די העכסטן פיייקייט צו סטימולירן צעל פּראָוליפעריישאַן (Fig. 3j).די רעזולטאַטן אָנווייַזן אַ positive קאָראַליישאַן צווישן די ביינדינג קאַפּאַציטעט און בייאַלאַדזשיקאַל פונקציע פון ​​​​DARS-AS1.
PACT איז רעפּאָרטעד צו זיין אַ פּראָ-אַפּאָפּטאָטיק פּראָטעין 19.דעריבער, מיר ינוועסטאַגייטאַד די ווירקונג פון DARS-AS1 אויף אַפּאָפּטאָסיס.ווי דערוואַרט, דאַרס-אַס1 נאַקדאַון באטייטיק געוואקסן פּאַרפּ קלעאַוואַגע אין SW620 סעלז און געוואקסן די פּראָפּאָרציע פון ​​אַנעקסין V-positive סעלז אין SW620, HCT116, HepG2 און MBA-MD-231 צעל שורות (Fig. 3 ק).3).3f-h), וואָס ינדיקייץ אַז די אַנטי-אַפּאָפּטאָטיק ווירקונג פון DARS-AS1 אין ראַק סעלז איז פאַרקערט צו די אַפּאָפּטאָסיס-ינדוסינג פונקציע פון ​​​​PACT.צוזאַמען, די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז די מעקאַניזאַם פון דאַרס-אַס1 אָנקאָגעניק פונקציע קען זיין דורך ינאַבישאַן פון PACT פונקציע.
דערנאָך, מיר ויספאָרשן די פאַנגקשאַנאַל ימפּלאַקיישאַנז פון די DARS-AS1-PACT פאַרבאַנד.PACT איז רעפּאָרטעד צו אַקטאַווייט PKR דורך דירעקט ינטעראַקשאַן, וואָס דערנאָך ימפּרוווז eIF2α פאָספאָרילאַטיאָן, קאָזינג טראַנסלאַטיאָן דילישאַן און אַפּאָפּטאָסיס 17.ערשטער, מיר יגזאַמאַנד צי DARS-AS1 אַפעקץ די סעליאַלער לאָוקאַלאַזיישאַן פון PACT און PKR.קאָנפאָקאַל פלורעסאַנס מיקראָסקאָפּי געוויזן אַז PACT און PKR זענען העכסט קאָלאָקאַליזעד אין SW620 סעלז מיט אַ דורכשניטלעך פּירסאָן קאָראַליישאַן קאָואַפישאַנט פון 0.72.דערווייַל, DARS-AS1 אָוווערעקספּרעססיאָן באטייטיק רידוסט PACT און PKR קאָ-לאָוקאַלאַזיישאַן (דויערן Pearson קאָראַליישאַן קאָואַפישאַנט 0.61) (פיגורע 4 אַ).צו פאָרשן צי DARS-AS1 קען מאָדולירן די PACT-PKR ינטעראַקשאַן, מיר דורכגעקאָכט אַ קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן (קאָ-IP) אַסייַ מיט אַנטי-PACT אַנטיבאָדי אין SW620 צעל ליסיז.פּקר איז געווען העכסט ענריטשט אין אַנטי-פּאַקט אין קאָנטראָל סעלז, בשעת פּקר אָפּזוך איז באטייטיק רידוסט אין ליסיז פון סעלז אָוווערעקספּרעססינג דאַרס-אַס1 (פיגורע 4ב).פּיוראַפייד מיטן נאָמען PACT און PKR זענען געניצט פֿאַר ינ וויטראָ פּראָטעין ביינדינג אַסאַסאַז.אַקקאָרדינגלי, יענע וואָס האָבן צוגעשטעלט DARS-AS1 אָבער קיין קאָנטראָל רנאַ געוויזן סאַפּרעסט PACT-PKR ינטעראַקשאַן (פיגורע 4c).אַלע רעזולטאַטן האָבן געוויזן אַז DARS-AS1 דיסראַפּטיד PACT און PKR קאָמוניקאַציע.
אַ קאָ-לאָוקאַלאַזיישאַן פון PACT און PKR אין קאָנטראָל סעלז אָדער סעלז אָוווערעקספּרעסינג DARS-AS1 איז באמערקט מיט קאַנפאָקאַל פלורעסאַנס מיקראָסקאָפּי.די נוקליי זענען סטיינד מיט DAPI.סטאַטיסטיש רעזולטאטן זענען באקומען פון 16 פאָוטאַגראַפס.ב קאָ-יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן (קאָ-IP) ניצן אַנטי-PACT אַנטיבאָדי אין צעל ליסיז פון קאָנטראָל סוו620 סעלז אָדער סעלז אָוווערעקספּרעססינג DARS-AS1.c לייבאַלד PACT, פּיוראַפייד PKR און טראַנסקריבעד אין וויטראָ מיט DARS-AS1 אָדער רייצנ רנאַ זענען ינקובייטיד פֿאַר ינ וויטראָ פּראָטעין ביינדינג אַנאַליסיס.אַנטי-פלאַך אַנטיבאָדיעס זענען געניצט פֿאַר יממונאָפּרעסיפּיטאַטיאָן.ד יממונאָבלאַץ מיט די אנגעוויזן אַנטיבאָדיעס זענען דורכגעקאָכט אין SW620 און HCT116 סעלז טראַנספעקטעד מיט קאָנטראָל שרנאַ אָדער דאַרס-אַס1-שרנאַ נאכגעגאנגען דורך סערום הונגער.e DARS-AS1 אויסדרוק לעוועלס אָלטערד סעליאַלער סענסיטיוויטי צו טהאַפּסיגאַרגין.SW620 סעלז זענען טראַנספעקטעד מיט DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 אָוווערעקספּרעססיאָן פּלאַזמיד אָדער קאָנטראָל פּלאַזמיד.סעלז זענען באהאנדלט מיט טהאַפּסיגאַרגין פֿאַר 48 שעה און צעל ווייאַבילאַטי איז באשלאסן מיט די MTS רייידזשאַנט.ף אין וויטראָ טראַנסקריבעד DARS-AS1 אָדער דאַמי רנאַ און פּיוראַפייד פּאַקט זענען געניצט פֿאַר ינ וויטראָ אַקטאַוויישאַן אַססייַ און יממונאָבלאָט דיטעקשאַן.ג יממונאָבלאַץ ניצן די אַנטיבאָדיעס זענען דורכגעקאָכט אויף SW620-ctrl סעלז (לינקס) אָדער סעלז אָוווערעקספּרעססינג PKR מיוטאַנץ (רעכט).די סעלז זענען דעמאָלט טראַנספעקטעד מיט קאָנטראָל שרנאַ אָדער דאַרס-אַס1-שרנאַ נאכגעגאנגען דורך סערום הונגער.ה פלאָו סיטאָמעטרי געוויזן אַז ינאַקטיוויישאַן פון די מוטאַנט PKR קאַמפּאַנסייטאַד פֿאַר DARS-AS1-ינדוסט אַפּאָפּטאָסיס אין SW620 סעלז.יממונאָבלאַץ מיט די אנגעוויזן אַנטיבאָדיעס זענען דורכגעקאָכט אין SW620 (לינקס) אָדער HCT116 (רעכט) סעלז.סעלז טראַנספעקטעד מיט קאָנטראָל שרנאַ אָדער DARS-AS1 שרנאַ זענען סערום-דיפּרייווד און סאַפּלאַמענטאַד מיט 100 nM PKR C16 ינכיבאַטער אָדער DMSO.וואָג באַר = 5 μם.דאַטן געוויזן זענען די דורכשניטלעך ± נאָרמאַל דיווייישאַן פון דרייַ יקספּעראַמאַנץ.* פּ ≤ 0.05 צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן.
עס איז בכלל געגלויבט אַז אַמאָל PACT ינטעראַקץ מיט PKR17, PKR פאָספאָרילאַטיאָן ביי Thr451 קענען זיין ינדוסט.אונדזער רעזולטאטן אנגעוויזן אַז די מדרגה פון פּקר פאָספאָרילאַטיאָן איז באטייטיק עלעוואַטעד אין דאַרס-אַס1 נאַקדאַון סעלז נאָך סערום הונגער (פיגורע 4 ד און סאַפּלאַמענערי פייג 4 אַ).אַקקאָרדינגלי, מיר געפונען אַז פאָספאָרילאַטיאָן פון eIF2α, די הויפּט פּקר סאַבסטרייט, איז אויך באטייטיק געוואקסן דורך DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d און Supplementary Fig. 4a).טהאַפּסיגאַרגין איז אַן ER סטרעסער וואָס ז די ער צו מעלדונג Ca2+.באַהאַנדלונג מיט טהאַפּסיגאַרגין איז רעפּאָרטעד צו ינדוסירן די אויסדרוק און אַקטאַוויישאַן פון PACT, וואָס ווייַטער ינטעראַקץ מיט און אַקטאַווייץ PKR, לידינג צו אַפּאָפּטאָסיס דורך ינקריסינג eIF2α פאָספאָרילאַטיאָן 18,61.דאָ, מיר געוויינט Thapsigargin ווי אַ סטימולאַטאָר פון די PACT / PKR פּאַטוויי צו פאָרשן צי DARS-AS1 קענען העלפֿן סעלז באַקומען דרוק דורך ינכיבאַטינג די PACT / PKR פּאַטוויי.מיר באמערקט אַז די מדרגה פון DARS-AS1 אויסדרוק דורכויס קאָראַלייטאַד מיט צעל קעגנשטעל צו טהאַפּסיגאַרגין.SW620 סעלז אָוווערעקספּרעססינג DARS-AS1 סערווייווד בעסער ווען באהאנדלט מיט טהאַפּסגאַרגין, בשעת סעלז מיט דאַרס-אַס1 נאַקדאַון געווארן מער סאַסעפּטאַבאַל (Fig. 4e).קאָנסיסטענט מיט די רעזולטאַטן, דאַרס-אַס1 אָוווערעקספּרעססיאָן רידוסט טהאַפּסיגאַרגין-ינדוסט פּקר פאָספאָרילאַטיאָן (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4ב).אין קאַנטראַסט, נאָך טהאַפּסיגאַרגין באַהאַנדלונג, PKR און eIF2α זענען פאָספאָרילאַטעד צו אַ העכער מאָס אין דאַרס-אַס1 נאַקדאַון סעלז קאַמפּערד צו קאָנטראָל סעלז (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 ב).ינטערעסטינגלי, טהאַפּסיגאַרגין ינדוסט DARS-AS1 אויסדרוק אין אַ דאָזע-אָפענגיק שטייגער, וואָס קען אָנווייַזן אַן אַנטי-דרוק פונקציע פון ​​​​DARS-AS1 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4c).אין אַדישאַן, מיר דורכגעקאָכט אין וויטראָ אַקטאַוויישאַן אַסייסאַז צו באַשטעטיקן די אַבזערוויישאַנז.בעקיצער, PKR איז פּיוראַפייד פון צעל ליסאַטעס ניצן אַן אַנטי-PKR אַנטיבאָדי, דערנאָך ינקובייטיד מיט רעקאָמבינאַנט PACT און DARS-AS1 טראַנסקריבעד אין וויטראָ.נאָך די ענזימאַטיק אָפּרוף, פאָספאָ-פּקר איז דיטעקטאַד מיט ווב.אונדזער רעזולטאַטן האָבן אנגעוויזן אַז PKR פאָספאָרילאַטיאָן איז באטייטיק ינכיבאַטיד דורך DARS-AS1, אָבער נישט דורך קאָנטראָל רנאַ (פיגורע 4f).די רעזולטאַטן אין וויטראָ און אין וויוואָו פֿאָרשלאָגן אַז DARS-AS1 ינכיבאַץ PACT-מעדיאַטעד PKR אַקטאַוויישאַן.אין דער זעלביקער צייט, מיר אויך באמערקט אַ פאַרקלענערן אין PACT אָפּזוך אין דעם בייַזייַן פון DARS-AS1 (פיגורע 4f).דער רעזולטאַט איז קאָנסיסטענט מיט די רעזולטאטן פון די ינ וויטראָ פּראָטעין ביינדינג אַססייַ (פיגורע 4c) און ווידער ילאַסטרייץ די בלאַקינג פונקציע פון ​​​​DARS-AS1 פֿאַר PACT-PKR פאַרבאַנד.
Ser246 און Ser287 אין די D3 פעלד פון PACT זענען פארלאנגט פֿאַר PKR אַקטאַוויישאַן אונטער סעליאַלער דרוק.סאַבסטיטושאַן פון צוויי סערינע רעזאַדוז פֿאַר אַלאַנינע האט מוטאַנט PACT (מוט), וואָס אַקטיווייטיד PKR אין דער אַוועק פון דרוק, און סאַבסטיטושאַן פֿאַר אַלאַנינע (מוטאַ) ריווערסט דעם פּראָטאָקאָל.זינט מיר האָבן דעמאַנסטרייטיד די וויכטיקייט פון דעם פעלד אין דירעקט פאַרבאַנד מיט DARS-AS1, מיר דזשענערייטאַד די צוויי PACT מיוטאַנץ צו פּרובירן צי די רעזאַדוז קען אויך זיין ינוואַלווד אין ינטעראַקשאַן מיט DARS-AS1.ינטערעסטינגלי, ביידע מיוטאַנץ פאַרפאַלן די פיייקייט צו בינדן צו DARS-AS1 (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4 ד), סאַגדזשעסטינג אַז די גאַנץ סטרוקטור פון די PACT פּראָטעין קען זיין פארלאנגט פֿאַר עפעקטיוו ינטעראַקשאַן מיט DARS-AS1.
דערצו, אונדזער רעזולטאַטן אויך פֿאָרשלאָגן אַז דאַרס-אַס1-שרנאַ-ינדוסט ינאַבישאַן פון צעל פּראָוליפעריישאַן קענען זיין טייל געזונט דורך אָוווערעקספּרעסינג אַ דאָמינאַנט נעגאַטיוו PACT מוטאַנט (PACTmutA) אָדער אַ דאָמינאַנט נעגאַטיוו PKR מוטאַנט (PKRmut) (סופּפּלעמענטאַרי פייג. 4e. E).אָווערעקספּרעססיאָן פון דאָמינאַנט-נעגאַטיוו פּקר מיוטאַנץ רידוסט פּקר פאָספאָרילאַטיאָן ינדוסט דורך דאַרס-אַס1 נאַקדאַון ווי געזונט ווי eIF2α פאָספאָרילאַטיאָן אין סערום-דיפּרייווד סעלז (Fig. 4g).מער ימפּאָרטאַנטלי, די פּראָפּאָרציע פון ​​אַפּאָפּטאָטיק סעלז ינדוסט דורך דאַרס-אַס1 נאַקדאַון איז אויך רידוסט אין סעלז אָוווערעקספּרעססינג פּקרמוט (Fig. 4h און Supplementary Fig. 4g).ינאַבישאַן פון PKR קינאַסע טעטיקייט אויך ימפּערז דאַרס-אַס1 פונקציאָנירן, ווי רעזולטאַטן געוויזן אַז דאַרס-אַס1 נאַקדאַון ראַרעלי טריגערד PKR און eIF2α פאָספאָרילאַטיאָן ווען סעלז זענען באהאנדלט מיט אַ פּקר-ספּעציפיש ק16 ינכיבאַטער (Fig. 4i און סאַפּלאַמענערי פייג. 4 ה).).צוזאַמען, אונדזער רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז DARS-AS1 פּראַמאָוץ צעל פּראָוליפעריישאַן, לפּחות טייל, דורך ינכיבאַטינג PACT-מעדיאַטעד PKR אַקטאַוויישאַן.
צו ווייַטער ויספאָרשן די ראָלע פון ​​​​DARS-AS1 אין טומאָריגענעסיס, מיר דורכגעקאָכט אין וויוואָו יקספּעראַמאַנץ מיט אַ מויז קסענאָגראַפט מאָדעל. רעזולטאטן ווייַזן אַז דאַרס-אַס 1 דראַמאַטיקלי דיקריסט אָנוווקס וווּקס אין מיסע (פּ ווערט <0.0001) (פיגורע 5 אַ). רעזולטאטן ווייַזן אַז דאַרס-אַס 1 דראַמאַטיקלי דיקריסט אָנוווקס וווּקס אין מיסע (פּ ווערט <0.0001) (פיגורע 5 אַ). דאַרס-אַס 1 רעזולטאטן זענען געראַנטיד דורך די דאַרס-אַס 1 קענען זיין פּראָטעקטעד צו דיין מיטל (באַצאָלט פּ <0,0001) (ריז. די רעזולטאַטן ווייַזן אַז דאַרס-אַס 1 נאַקדאַון דראַסטיקלי ראַדוסאַז אָנוווקס וווּקס אין מיסע (פּ ווערט <0.0001) (פיגורע 5 אַ).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（㛀5a）结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值<0.0001）（图5a。 די רעזולטאטן פון דאַרס-אַס 1 זענען בנימצא אין דער זעלביקער צייט (אַרייַנגערעכנט <0,0001) (5). די רעזולטאַטן געוויזן אַז DARS-AS1 נאַקדאַון באטייטיק רידוסט אָנוווקס וווּקס אין מיסע (פּ ווערט <0.0001) (פיגורע 5 אַ).אזוי, אין די DARS-AS1 נאַקדאַון גרופּע, עס איז געווען אַ באַטייטיק פאַרקלענערן אין די דורכשניטלעך אָנוווקס באַנד מיט וועגן 72.9% און די דורכשניטלעך אָנוווקס מאַסע מיט וועגן 87.8% (פיגורע 5b-d).די רעזולטאַטן שטארק פֿאָרשלאָגן אַז DARS-AS1 קענען באטייטיק העכערן אָנוווקס גראָוט אין וויוואָו.
יפעקץ פון אַד DARS-AS1 נאַקדאַון אויף קאָלאָרעקטאַל אָנקאָגענעסיס אין נאַקעט מיסע.גראָוט קורוועס (אַ), אָנוווקס גרייס (ב), וואָג (C), און אָנוווקס בילדער (ד) זענען געוויזן.טעות באַרס פאָרשטעלן ± סעם. n = 10. ****p <0.0001, דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ה פּראָבע. n = 10. ****p <0.0001, דורך צוויי-טיילד תּלמיד ס ה פּראָבע. n = 10. ****p < 0,0001 פֿאַר די לעצטע קרעדיט קאָרט. n = 10. ****p <0.0001 צוויי-טיילד תּלמיד ס ג-פּרובירן.n = 10. ****p <0.0001，通过双尾学生t 检验. ****p <0.0001，通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 פֿאַר פּריוואַט קריטעריוס. ****p <0.0001 צוויי-טיילד תּלמיד ס ה-פּרובירן.e Kaplan-Meier אַנאַלייזד די קאָראַליישאַן צווישן DARS-AS1 אויסדרוק לעוועלס און קוילעלדיק ניצל אין פּאַטיענץ מיט UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM און LGG.הויך לעוועלס פון DARS-AS1 אויסדרוק אין פּאַטיענץ זענען געווען אין די שפּיץ 50%;די נידעריק מדרגה פון DARS-AS1 אויסדרוק אין פּאַטיענץ איז געווען אין די דנאָ 50%.p-וואַלועס זענען באשלאסן מיט די קלאָץ ריי פּרובירן.f פארגעלייגט מאָדעל אין וואָס DARS-AS1 רעגיאַלייץ די PACT-PKR פּאַטוויי און אָנוווקס גראָוט.
צו בעסער פֿאַרשטיין די קליניש פּראַל פון DARS-AS1, מיר יגזאַמאַנד די קאָראַליישאַן צווישן זייַן אויסדרוק און פּאַציענט ניצל.דורך אַנאַלייזינג די TCGA דאַטאַסעט, מיר געפֿונען אַז העכער DARS-AS1 אויסדרוק איז געווען פֿאַרבונדן מיט ווועאַל מעלאַנאָומאַ (UVM), רענאַל טשראָמאָפאָביאַ (KICH), רענאַל פּאַפּיללאַרי צעל קאַרסינאָמאַ (KIRP), מעסאָטהעליאָמאַ (MESO), מולטיפּלעקס.נידעריקער ניצל איז באטייטיק פארבונדן מיט גליאָבלאַסטאָמאַ מאָרפאָסיס (גבם) און פּאַטיענץ מיט נידעריק-מיינונג מאַרך גליאָמאַ (לגג) (פיגורע 5e).די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז DARS-AS1 קען שפּילן אַ וויכטיק ראָלע אין קליניש אָנוווקס פּראַגרעשאַן און קען זיין אַ פּאָטענציעל פּרידיקטיוו ביאָמאַרקער אין קייפל קאַנסערץ.
אין דעם לערנען, ניצן גרויס-וואָג CRISPRI פאַנגקשאַנאַל זיפּונג, מיר באשלאסן אַז DARS-AS1 lncRNA מנצח ראַק צעל דרוק דורך רעגיאַלייטינג צוויי שליסל דרוק ריספּאַנדערז, PACT און PKR.דורך ינטעראַקטינג גלייַך מיט PACT, DARS-AS1 ינכיבאַטיד PACT-מעדיאַטעד PKR אַקטאַוויישאַן, דערמיט פּרעווענטינג אַפּאָפּטאָטיק צעל טויט און פּראַמאָוטינג צעל פּראָוליפעריישאַן (Fig. 5f).ופּרעגולאַטיאָן פון DARS-AS1 איז באמערקט אין קייפל טייפּס פון ראַק, סאַגדזשעסטינג אַז זייַן פונקציע פון ​​פּראַמאָוטינג ראַק צעל ניצל אונטער סטרעספאַל טנאָים קען זיין ברייט אָנווענדלעך צו קייפל טייפּס פון ראַק.
PACT איז יידענאַפייד ווי אַ PKR אַקטיוואַטאָר פּראָטעין, און PACT-מעדיאַטעד PKR אַקטאַוויישאַן פיעסעס אַ וויכטיק ראָלע אין דרוק רעספּאָנסעס דורך רעגיאַלייטינג טראַנסקריפּציע, איבערזעצונג, אַפּאָפּטאָסיס און אנדערע וויכטיק סעליאַלער פּראַסעסאַז62.פֿאַר דעקאַדעס, פרווון האָבן שוין געמאכט צו פֿאַרשטיין די ראַק-ספּעציפיש רעגולירן פון די PACT-PKR קאַסקייד.דאָ, אונדזער לערנען אנטפלעקט אַ אַנדערש מעקאַניזאַם פון רעגולירן פון PACT-PKR אין ראַק סעלז דורך סעליאַלער LncRNA DARS-AS1, וואָס גלייך ביינדז צו PACT, בלאַקס PACT-PKR ינטעראַקשאַן, ינכיבאַץ PKR אַקטאַוויישאַן און eIF2α פאַספעראַליישאַן, דערמיט ינכיבאַטינג דרוק-ינדוסט אַפּאָפּטאָסיס און סטימיאַלייטינג עווענטואַל ראַק פּראָוליפעריישאַן.סעלז.די ופדעקונג אָפּדאַך ליכט אויף פּאָטענציעל lncRNA טאַרגאַץ פֿאַר ראַק פּראָגנאָסיס און טעראַפּיע.
אונדזער דאַטן געוויזן אַז DARS-AS1 נאַקדאַון סענסיטיזיז סעלז צו סערום הונגער מיט אַ באַטייטיק פאַרגרעסערן אין פאָספאָרילאַטעד PKR און eIF2α.די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז DARS-AS1 פּראַמאָוץ ראַק צעל ניצל אונטער האַרב טנאָים דורך ינכיבאַטינג PACT / PKR טעטיקייט.עטלעכע אנדערע ניט-קאָדינג רנאַ, אַזאַ ווי ASPACT און nc886, זענען אויך ינוואַלווד אין די PACT / PKR אַקס דורך דאַונרעגיאַלייטינג PACT48 mRNA אָדער רעגיאַלייטינג אַוטאָפאָספאָרילאַטיאָן דורך ביינדינג צו PKR49,50,64.צווישן זיי, DARS-AS1 אקטן ווי אַ דיסראַפּטער פון די PACT-PKR פאַרבאַנד.דער לערנען ענריטשיז אונדזער פארשטאנד פון PACT / PKR אַקס רעגולירן און די ראָלע פון ​​​​לנקרנאַס אין דרוק רעספּאָנסעס.
PACT כּולל דריי באַזונדער דאָומיינז.יעדער פון די ערשטער צוויי דסרבד איז גענוג צו דערגרייכן הויך קירבות ביינדינג פון PACT צו PKR, בשעת די דריט פעלד (D3) איז פארלאנגט פֿאַר PKR אַקטאַוויישאַן אין וויטראָ און אין וויוואָו.אונדזער לערנען געוויזן אַז DARS-AS1 פּרעפערענטשאַלי ינטעראַקץ מיט די D3 פעלד (Fig. 3h).געגעבן די גרויס גרייס פון די lncRNA (768 נוקלעאָטידעס), DARS-AS1 ביינדינג צו D3 קענען פיזיקלי ינכיבאַט די ינטעראַקשאַן צווישן די PACT פעלד פון dsRBD און PKR, און דערמיט בלאַקינג די פאַרבאַנד פון PACT און PKR.PACT פונט מיוטיישאַנז וואָס ריפּלייסט Ser246 און Ser287 אין D3 מיט אַלאַנינע אָדער אַספּאַרטאַטע דיסראַפּטיד זייַן ביינדינג קירבות פֿאַר DARS-AS1, ווייזן צו די וויכטיקייט פון D3 ס קוילעלדיק סטראַקטשעראַל און עלעקטריקאַל פּראָפּערטיעס אין זייער פאַרבאַנד.ווייַטער דעטאַילס פון דעם מעקאַניזאַם וועט זיין פארלאנגט אין דער צוקונפֿט, ניצן מער גענוי בייאָוקעמיקאַל אַנאַליסיס און הויך האַכלאָטע PACT סטראַקטשעראַל אַנאַליסיס.
פריער שטודיום האָבן געמאלדן אַז DARS-AS1 פּראַמאָוץ צעל פּראָוליפעריישאַן דורך עטלעכע מעקאַניזאַמז51,52,53.אין איין ביישפּיל, ינוועסטאַגייטערז באמערקט אַז DARS-AS1 אַפּרעגיאַלייטיד זייַן אַנטיסענסע פּראָטעין-ענקאָדינג DARS דזשין דורך טאַרגאַטינג miP-194-5p אין ניר ראַק סעלז.אָבער, אין די פאָרשטעלן לערנען, DARS-AS1 נאַקדאַון האט אַ קליין ווירקונג אויף דאַרס טראַנסקריפּציע אין קייפל טייפּס פון ראַק, אַרייַנגערעכנט אין מינדסטער קאָלאָרעקטאַל, ברוסט און לעבער קאַנסערץ.ווייַל lncRNAs ויסשטעלונג צעל- און געוועב-ספּעציפיש אויסדרוק פּאַטערנז, פאַנגקשאַנאַל מעקאַניזאַמז קען נישט זיין קאַנסערווד צווישן ראַק טייפּס, וואָס קען ביישטייערן צו דעם דיסקרעפּאַנסי צווישן אונדזער אַבזערוויישאַנז און פרייַערדיק אַסעסמאַנץ פון פאַרשידענע קאַנסערץ.ספּעציעלע שטודיום זענען דארף צו דערקלערן די ספּעציפיש מעקאַניזאַמז פון פאַרשידן פיזיאַלאַדזשיקאַל און פּאַטאַלאַדזשיקאַל פּראַסעסאַז.
אַן אַנאַליסיס פון קליניש דאַטן געוויזן אַז DARS-AS1 אויסדרוק אין טומאָרס איז פאַרקערט קאָראַלייטאַד מיט די ניצל פון ראַק פּאַטיענץ, וואָס אַנדערליינז די וויכטיקייט פון די DARS-AS1 / PACT / PKR אַקס אין ראַק פּראָגנאָסיס.אין מסקנא, אונדזער לערנען ווייזט אַז DARS-AS1 איז אַ רעגולאַטאָר פון די PACT / PKR סיגנאַלינג אַקס, פּראַמאָוץ ראַק צעל פּראָוליפעריישאַן און ינכיבאַץ אַפּאָפּטאָסיס בעשאַס די דרוק ענטפער, וואָס גיט אן אנדער שורה פון פאָרשונג און איז פון אינטערעס פֿאַר צוקונפֿט פאָרשונג אין פּאָטענציעל טריטמאַנץ. .
מענטשנרעכט צעל שורות SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 און HEK293T זענען באקומען פון די נאַשאַנאַל צעל ליניע ריסאָרס ינפראַסטראַקטשער אין טשיינאַ.אַלע סעלז זענען מיינטיינד אין DMEM מיטל (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) סאַפּלאַמענטאַד מיט 10% פבס (געמיני, ברוקלין, ניו יאָרק) און 1% פּעניסיללין-סטרעפּטאָמיסין (טערמאָ פישער ססיענטיפיק) ביי 37 ° C, 5% CO2.ינגקיאַבייטער.
אַנטי-פּאַקט, אַבקאַם (אַב31967);אַנטי-פּקר, אַבקאַם (אַב184257);אַנטי-פּקר (פאָספאָ-ט451), אַבקאַם (אַב81303);אַנטי-פלאַג, אַבקאַם (אַב125243);אַנטי-עיפ2α, אַבקאַם (אַ0764));אַנטי-עיפ2α (פאַספעראַס ס51), אַבקאַם (אַב32157);אַנטי-פּאַקט (פאַספעראַס ס 246), אַבגענט (אַפּ7744 ב);אַנטי-β-טובולין, קסט (2128);נאָרמאַל מויז IgG, CST (5415S);נאָרמאַל קיניגל IgG, CST (2729S).אַנטיבאָדיעס זענען דיילוטאַד 1:1000 אין פּבסט פֿאַר מערב בלאָטינג און 1:100 פֿאַר IP.
sgRNAs זענען דעוועלאָפּעד מיט אַ עפנטלעך בנימצא געצייַג גערופן CRISPR-ERA66.מיר געוויינט די פעליקייַט געצייַג פּאַראַמעטערס פֿאַר סגרנאַ אַנטוויקלונג און די אַלגערידאַם קאַמפּיוטיד סגרנאַ ביינדינג זייטלעך אין די 3 קב געגנט.סענטערד אין TSS.פּאָאָלס פון סגרנאַ אָליגאָנוקלעאָטידעס זענען סינטאַסייזד ביי CustomArray, ינק. (באָטהעוועלל, WA) און קלאָונד אין כיומאַנייזד פּגרנאַ פּלאַסמיידז (Addgene #44248).א גאַנץ פון 12 μג פון פּאָאָלעד כיומאַנייזד פּגרנאַ פּלאַזמיד, 7.2 μג פון פּספּאַקס 2 (אַדדזשין #12260), און 4.8 μג פון pMD2.G (Addgene #12259) זענען קאָ-טראַנספעקטעד אין 5 x 106 HEK293T מיט דנאַ 10 טראַנספעקטיאָן קיילים. סעלז (CWBIO, בעידזשינג, טשיינאַ) לויט דער פאַבריקאַנט ס ינסטראַקשאַנז.ווירוס-מיט סופּערנאַטאַנץ זענען געזאמלט 48 און 72 שעה נאָך טראַנספעקשאַן און פילטערד דורך אַ 0.45 μם פילטער.פֿאַר זיפּונג, SW620 סעלז יקספּרעסינג די dCas9 / KRAB פוסיאָן פּראָטעין זענען באקומען דורך ווירוס טראַנסדוקציע.מאָדיפיעד SW620 סעלז זענען ינפעקטאַד מיט די ווירוס ביבליאָטעק אין פיר פרייַ ינפעקציע יקספּעראַמאַנץ אין אַ MOI פון 0.1-0.3 און זענען סאַמפּאַלד מיט 2 μג / מל פּוראָמיסין (סיגמאַ, סט. לאָויס, מאָ) פֿאַר 2 טעג.דערנאָך, סעלז זענען קאַלטשערד פֿאַר 18 טעג אין וויטראָ מיט אַ מינימום ביבליאָטעק קאַווערידזש פון 500 סעלז / סגרנאַ פֿאַר זיפּונג.
גענאָמיק דנאַ איז יקסטראַקטיד לויט די ינסטראַקשאַנז פון די QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, דייַטשלאַנד; 51183).אין גאַנץ, 100 μג פון גענאָמיק דנאַ פּער בייאַלאַדזשיקאַל איבערחזרן איז געניצט צו בויען די ביבליאָטעק.די sgRNA געגנט איז אַמפּלאַפייד דורך צוויי ראָונדס פון פּקר און לינגקט צו אַ באַרקאָדע.
פּקר פּראָדוקטן זענען פּיוראַפייד מיט NucleoSpin® געל און פּקר רייניקונג קיט (MACHEREY-NAGEL, Düren, דייַטשלאַנד; 740609.250) און קוואַנטאַפייד מיט Qubit ™ HS טאָפּל-סטראַנדיד דנאַ דיטעקשאַן קיט (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
די MTS אַסיי איז געניצט צו מעסטן צעל פּראָוליפעריישאַן.סעלז זענען סידעד אין 96-געזונט פּלאַטעס אין אַן ערשט געדיכטקייַט פון 2000 סעלז / געזונט.די קאָרעוו נומער פון סעלז איז געמאסטן טעגלעך אין די אנגעוויזן צייט פֿאַר אַ גאַנץ פון 4-6 טעג.פֿאַר יעדער געזונט, 20 μl MTS רייידזשאַנט (פּראָמעגאַ) איז דיילוטאַד מיט 100 μl DMEM, ינקובייטיד מיט סעלז פֿאַר 4 שעה ביי 37 ° C, און OD490 איז געמאסטן.
די קאַפּאַציטעט פֿאַר אַנאַנגקערד וווּקס איז דיסקאַווערד דורך אַנאַלייזינג די פאָרמירונג פון ספערעס.בעקיצער, 2000 סעלז טראַנספעקטעד מיט shRNA DARS-AS1 אָדער קאָנטראָל שרנאַ זענען קאַלטשערד אין הינטער נידעריק אַטאַטשמאַנט מיקראָפּלאַטעס (קאָרנינג) מיט מיטל ענדערונג יעדער 4 טעג.די ספעראָידס זענען גערעכנט נאָך 14 טעג.500 סעלז טראַנספעקטעד מיט די DARS-AS1 אָווערעקספּרעססיאָן פּלאַזמיד אָדער אַ קאָנטראָל פּלאַזמיד זענען געניצט פֿאַר די ענכאַנסמאַנט אַססייַ, אַנדערש דער אופֿן איז אַנטשיינדזשד.
רנאַ איז טראַנסקריבעד מיט ט 7 רנאַ פּאָלימעראַסע און ביאָטין-16-וטפּ (ראָטשע 1138908910) לויט די ינסטראַקשאַנז פון ריבאָפּראָבע® קאָמבינאַטיאָן סיסטעמס (פּראָמעגאַ פּ1440).די אָנפאַנגערס געניצט דאָ זענען ליסטעד אין סאַפּלאַמענטערי טאַבלע 4.
פּראָטעין-קאָדינג PACT אָדער PKR מקומות זענען קלאָונד אין pET15b (Addgene #73619) און פארוואנדלען אין BL21 (DE3).די באַקטיריאַ זענען ינגקיובייטיד יבערנאַכטיק אין לב סאַפּלייד מיט אַמפּיסיללין און דעמאָלט דיילוטאַד 100-פאַרלייגן מיט פריש לב.ווען די OD600 פון די מיטל ריטשט 0.8, 1 מם יפּטג איז צוגעגעבן צו ינדוסירן פּראָטעין אויסדרוק.נאָך ינגקיוביישאַן יבערנאַכטיק מיט מילד שאַקינג (250 רפּם ביי 20 ° C), די צעל שרייטל איז געזאמלט דורך סענטריפוגאַטיאָן (4000 רפּם, 10 מינוט, 4 ° C).רעסאַספּענשאַן די צעל שרייטל אין ליסיס באַפער (50 מם טריס, ף 8.0, 250 מם נאַקל, 1 מם PMSF) און ינקובייט אויף אייז פֿאַר 30 מינוט, דעמאָלט סאָניקאַטע (15 מינוט, 5 s אויף / אַוועק, אויף אייז) און סענטריפודזש (13,000). רפּם)., 30 מין, 4 ° С).דער סופּערנאַטאַנט איז דעמאָלט לאָודיד אַנטו Ni-NTA סמאָלע (QIAGEN) 3 מאל ביי 4 ° C, געוואשן 4 מאל מיט וואַשינג באַפער (50 מם טריס, ף 8.0, 40 מם ימידאַזאָלע, 250 מם נאַקל) און ילוטאַד 3 מאל, מיט אַ גאַנץ פון 10 מל עלוענט באַפער (50 מם טריס, ף 8.0, 250 מם נאַקל, 300 מם ימידאַזאָלע).פּיוראַפייד פּראָטעין איז געווען באשלאסן מיט ווב און די קאַנסאַנטריישאַן איז באשלאסן מיט די Qubit ™ פּראָטעין אַסיינמאַנט ינווענטאַר (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
ריפּ אַסייז זענען דורכגעקאָכט ווי פריער דיסקרייבד, מיט מאָדיפיקאַטיאָנס.בעקיצער, 1 קס RIP באַפער (25 מם טריס-הקל, ף 7.5, 100 מם נאַקל, 0.5% נפּ-40, רנאַסין ריבאָנוקלעאַסע ינכיבאַטער (פּראָמעגאַ), פּמסף (בייאָטימע ביאָטעטשנאָלאָגי), 1 מם דדם, פּראָטעאַסע) ליסיז סיטאָסטאַטיק 1 רענטגענ 107 קאָקטייל. (ראָטשע, 1 מם דטט) און סענטריפודזש ביי 13,000 רפּם פֿאַר 15 מינוט בייַ 4 °C.דער סופּערנאַטאַנט איז דעמאָלט ינקובייטיד מיט פּראָטעין א + ג מאַגנעטיק קרעלן (מיליפּאָרע) קאָנדזשוגאַטעד מיט 5 μג פון אַנטי-פּאַקט אַנטיבאָדי (אַבאַם) אָדער יגג (קסט).די קרעלן זענען געוואשן 5 מאל מיט 5 קס ריפּ באַפער, דעמאָלט דיידזשעסטיד מיט פּראָטעינס ק (נעב).רנאַ איז יקסטראַקטיד מיט טריזאָל און באשלאסן דורך RT-qPCR.אָנפאַנגערס זענען דערלאנגט אין סאַפּלאַמענטערי טאַבלע 5.
די אין וויטראָ ריפּ אַססייַ איז דורכגעקאָכט לויט אַ מאַדאַפייד נאָרמאַל RIP אַססייַ פּראָטאָקאָל.א גאַנץ פון 5 פּמאָל פון אין וויטראָ טראַנסקריבעד רנאַ איז דיילוטאַד 1 קס מיט ריפּ באַפער און אַנניילד דורך ינגקיוביישאַן ביי 65 ° C פֿאַר 5 מינוט נאכגעגאנגען דורך פּאַמעלעך קאָאָלינג צו צימער טעמפּעראַטור.א גאַנץ פון 5 פּמאָל פון בעשאָלעם אָדער מיוטייטיד פאָן-לייבאַלד PACT פּראָטעינס זענען פּיוראַפייד פון E. קאָלי.ינגקיובייט מיט רנאַטשערד רנאַ פֿאַר 2 שעה בייַ 4 ° C און נאָכגיין די אויבן פּראָצעדור פֿאַר RIP אַנאַליסיס פֿאַר אַנטי-פלאַך IP.
פֿאַר רנאַ געשפּרייט אַנאַליסיס, 1 × 107 סעלז זענען ליסעד מיט 1xRIP באַפער.נאָך סענטריפוגיישאַן ביי 13,000 רפּם פֿאַר 15 מינוט ביי 4 ° C, די סופּערנאַטאַנט איז פּרעטרעאַטעד מיט 30 μל סטרעפּטאַווידין מאַגנעטיק קרעלן (בעקמאַן) פֿאַר 2 שעה ביי 4 ° C.די פּיוראַפייד ליסאַטע איז דעמאָלט סאַפּלייד מיט הייוון טרנאַ און ינקובייטיד מיט 40 פּמאָל פון רנאַטשערד רנאַ יבערנאַכטיק ביי 4 ° C, און פֿאַר נאָך 2 שעה און 20 μל פון נייַ סטרעפּטאַווידין מאַגנעטיק קרעלן אפגעשטעלט מיט BSA איז צוגעגעבן.די וואַשינג שריט איז געווען 4 מאל מיט 5 קס ריפּ באַפער און 4 מאל מיט 1 קס ריפּ באַפער.די קאָראַספּאַנדינג פּראָטעינס זענען ילוייטיד מיט ביאָטין ילושאַן באַפער (25 מם טריס-הקל, ף 7.5, 12.5 מם ד-ביאָטין, פּמסף) און אפגעשיידט אויף NuPAGE 4-12% ביס-טריס געל (ינוויטראָגען).נאָך זילבער סטיינינג (בעיאָטימע ביאָטעטשנאָלאָגי), עטלעכע באַנדס זענען יקסידיד און אַנאַלייזד דורך MS.
קאָ-IP אַנאַליסיס איז דורכגעקאָכט צו פּרובירן די ינטעראַקשאַן צווישן PACT און PKR.בעקיצער, סופּערנאַטאַנט ליסיז זענען צוגעגרייט דורך ינקובאַטינג 1 קס 107 ליסעד סעלז אין 1 קס ריפּ באַפער נאכגעגאנגען דורך סענטריפוגיישאַן ביי 13,000 רפּם פֿאַר 15 מינוט ביי 4 ° C.ליסאַטעס זענען לאָודיד מיט פּראָטעין א + ג מאַגנעטיק קרעלן, קאָנדזשוגאַטעד מיט 5 μג פון אַנטי-פּאַקט אַנטיבאָדי, און דזשענטלי ראָוטייטיד יבערנאַכטיק ביי 4 ° סי.די קרעלן זענען געוואשן 3 מאל מיט 5 × ריפּ באַפער, צוויי מאָל מיט 1 × ריפּ באַפער און ילוטאַד מיט 1 × סדס באַפער.די ריקאַווערד פּראָטעין איז אַנאַלייזד דורך SDS-PAGE געל און דיטעקטאַד דורך ווב.
צוויי פּמאָל פון פלאַגד פּאַקט און 1 פּמאָל פון פּקר זענען פּיוראַפייד פון E. קאָלי.צעפירן אין 1 × ריפּ באַפער און ינגקיובייט מיט 10 פּמאָל פון רנאַטשערד רנאַ פֿאַר 2 שעה ביי 4 °C.נאָך דעם, זיי זענען ינקובייטיד מיט פּראָטעין א + ג מאַגנעטיק קרעל-קאָנדזשוגאַטעד אַנטי-לייבאַלד אַנטיבאָדי פֿאַר נאָך צוויי שעה.די קרעלן זענען דעמאָלט געוואשן פיר מאל מיט 1 קס ריפּ באַפער און ילוטאַד מיט 1 קס סדס באַפער.די ריזאַלטינג PACT און PKR זענען דיטעקטאַד דורך WB.